hmgb1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响.docx

hmgb1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响.docx

《hmgb1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《hmgb1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

hmgb1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响

                      作者：

韩红莉杨柳絮吴红样赵中夫【摘要】 目的：

探讨高迁移率族蛋白b1（hmgb1）对肝星状细胞（hepaticstellatecellhsc）合成细胞外基质（extracellularmatrixecm）的影响。

方法：

剂量效应组分别用含hmgb10mg/l,0.1mg/l,1.0mg/l,10mg/l，20mg/l和40mg/l的hmgb1培养液培养hsc-t66h；时间效应组以含有10mg/lhmgb1的培养液培养0h、6h、12h、18h和24h,对照组以不含hmgb1的培养液分别培养hsc-t6细胞，留取各组培养液离心后的上清，用双抗体夹心elisa方法检测其上清中p?

p和c?

的含量。

结果：

对照组hsc-t6细胞ecm分泌量较低；hsc-t6的ecm分泌量与hmgb1呈剂量依赖关系（r=0.835,0.955，p<0.05）；10mg/lhmgb1时间效应组的p?

p,c?

分泌量在18h和24h均明显高于对照组（p<0.05）。

结论：

hmgb1能诱导hsc-t6细胞分泌ecm，可能在肝纤维化的发生、发展中发挥重要作用。

【关键词】 hmgb1；hsc-t6；细胞外基质；肝纤维化   abstract objective:

toinvestigatetheeffectofhumanhighmobilitygroupbox1protein（hmgb1）ontheextracellularmatrixsecretionofrathepaticstellatecellandexplorethefunctionofhmgb1intheoccurrenceanddevelopmentofhepaticfibrosis.methods:

theeffectsofvariousdosesofhmgb1ontheecmsecretionofthehsc-t6cells:

cellsweredividedintosixgroups（0mg/l,0.1mg/l,1.0mg/l,10mg/l,20mg/l,40mg/l）,eachgroupcellswerestimulatedbydifferentconcentrationsofhmgb1for6h;therelationshipstimulatedtimeofhmgb1andsecretionofecminhsc-t6cells:

cellsweredividedintocontrolgroupandstimulatedgroups（0h,6h,12h,18h,24h,hmgb110mg/l）.thep?

pandc?

ofculturesupernatantweredetectedbyelisamethod.results:

thesecretionofecminthecontrolgroupswaslow,butitwasobviouslyincreasedinthestimulatedgroups.anditwasincreasedastimewenton（0h-24h）andthesecretionofecminstimulatedgroupswereobviouslyhigherthanincontrolgroupsat18h,24h（p<0.05）.therewassignificantlydose-dependentrelationshipin0.1mg/l-10mg/lscope（r=0.835,0.955，p<0.05）.conclusion:

thesecretionofecminhsc-t6cellwasinducedbyhmgb1whichcouldplayanimportantroleinthedevelopmentofhepaticfibrosis.   keywords hmgb1;hsc-t6;ecm;hepaticfibrosis  目前认为，hsc的激活是肝纤维化发生发展的关键环节［１］，hsc激活的始动因素是肝损伤和炎症反应，而hsc激活的过程包括早期启动激活和后期“持久化”激活，激活的“持久化”是维持hsc激活状态及产生ecm的必要条件。

多种急性肝损伤因素虽能引发早期启动激活，但因为缺乏“持久化”激活因素，所以不会导致肝纤维化或肝硬化的发生（如hav/hbv引起的急性肝炎），而各种慢性感染或慢性炎症反应能持续激活hsc（如   hcv/hbv引起的慢性肝炎），因此，慢性炎症反应的持续存在是hsc激活“持久化”的基础。

近年来，随着对炎症反应认识的深入，人们发现了一种有效的炎症介质hmgb1,它具有较其他细胞因子释放晚和作用时间长的特点［２］。

那么hmgb1是否对肝纤维化的发生、发展发挥重要作用呢？

我们课题组的先前研究表明在肝纤维大鼠的肝组织中hmgb1的表达明显增强，但hmgb1是否通过激活hsc参与肝纤维化的发生发展目前尚不清楚，本研究拟通过hmgb1刺激hsc以观察ecm的合成情况来进一步探讨hmgb1与肝纤维化的关系。

   1 材料与方法   1.1 主要试剂   hmgb1由本室制备保存；新生胎牛血清（fcs）为杭州四季青生物工程材料研究所产品；高糖型dmem购自英国gibco公司；大鼠p?

p，c?

双抗体夹心elisa检测试剂盒购自上海晶天生物科技有限公司（进口分装）；hsc-t6细胞株由北京地坛医院肝病研究所惠赠。

   1.2 实验分组及处理   大鼠hsc-t6细胞系在含10%的胎牛血清的dmem培养基中培养传代4次至对数生长期,调整细胞数为2×105密度接种于6孔培养板中,每孔1ml,细胞贴壁后改用2%的胎牛血清的dmem培养液同步饥饿培养2h,使培养细胞处于g0期后做下面实验：

    hmgb1的剂量效应组：

分别用含有0mg/l、0.1mg/l、1.0mg/l、10mg/l、20mg/l和40mg/l的hmgb1培养液培养hsc-t6，6h后,收集hmgb1刺激孔及对照孔培养上清液，用双抗体夹心elisa法测hsc-t6培养上清液中p?

p，c?

的含量。

以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。

    hmgb1的时间效应组：

刺激组（10mg/lhmgb1）和正常对照组（等量的pbs）分别用含10mg/lhmgb1和等量的pbs的dmem培养液培养hsc-t6细胞0h、6h、12h、18h和24h,同上收集培养上清液用双抗体夹心elisa方法测hsc-t6培养上清液中p?

p，c?

的含量。

以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。

   1.3 统计学方法   　采用spss12.0统计软件，进行spearman相关分析，单因素anova（方差分析），两样本比较采用lsd-t检验，实验数据均以（x±s）表示,p＜0.05判定有显著性差异。

   2 结果   2.1. hmgb1对hsc-t6分泌p?

p、c?

的剂量效应   hmgb1能促进hsc-t6分泌p?

p、c?

，在一定浓度范围内（0.1mg/l～10mg/l）呈剂量依赖关系（r=0.835，0.955，p<0.05），当hmgb1浓度为10mg/l时，hmgb1显著促进hsc-t6分泌p?

p、c?

并达峰值，当hmgb1浓度为20mg/l时，hsc-t6p?

p、c?

的分泌量与10mg/l时相当，hmgb1浓度为40mg/l时分泌量下降。

（见表1）表1 不同剂量的hmgb1对hsc分泌ecm的影响　　2.2. hmgb1对hsc-t6分泌p?

p,c?

的时间效应   刺激组hsc-t6分泌p?

p、c?

在0h～24h间呈递增趋势,随着时间的延长增加,呈时间依赖关系（r=0.970，0.982，p<0.05），正常对照组上清液p?

p、c?

含量变化趋势与hmgb1刺激组一致。

在6h和12h两组上清液p?

p、c?

的含量无显著差异（p>0.05），但在18h、24h刺激组上清液p?

p,c?

含量明显高于正常对照组（p<0.05）（见图1,图2）。

   3 讨论   　 目前认为hsc在肝纤维化的进程中起重要的作用,在慢性损伤因素的持续作用下,肝脏内大量的细胞因子分泌，其中最主要的有tgf-β、pdgf等［３］，可以使静止的hsc活化、增殖，产生大量的细胞外基质（ecm）沉积于肝组织,由于其在肝纤维化中的特殊性地位。

因此，体外培养hsc常作为肝硬化基础及实验治疗研究的重要手段［４～11］。

一般认为，原代培养的hsc适用于研究相对静止的hsc生物学行为,而传代培养的hsc适用于研究活化的hsc生物学行为,本实验研究hsc的激活机制适宜选择静止状态的hsc，但原代hsc仅占肝脏非实质细胞数的5%～10%，不管采用何种分离技术，最终得率很低。

此外，原代培养的hsc细胞不甚稳定，细胞分离状况及培养条件对实验结果的影响较大，为克服上述缺陷，目前逐渐倾向以hsc系代替原代hsc作为研究的靶细胞，并已建立若干hsc系。

本研究采用的hsc-t6细胞系是由大鼠肝星状细胞经过sv40病毒转染后形成的永生细胞系,具有无限传代的特性，是肝纤维化研究的良好模型。

ecm过度沉积是肝纤维化形成中关键的一步，ecm主要包括:

（1）胶原:

?

型,?

型,?

型、?

型。

（2）蛋白多糖:

硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸等。

（3）糖蛋白:

层粘连蛋白、纤维连接蛋白、副层粘连蛋白、副纤维连接蛋白、粗纤维调节素。

纤维化的肝脏含6倍于正常肝脏的胶原，其中?

?

和?

型胶原的含量显著增高。

因此，检测ecm成分的含量常作为肝纤维化的辅助诊断手段［１２～13］，目前认为p?

p，c?

层粘连蛋白及透明质酸是最具代表性的肝纤维化血清学指标，因此在实验中我们采用体外培养的hsc作为研究的靶细胞,用elisa方法检测培养细胞上清液中p?

p，c?

的含量。

本实验所用的hsc是经过传代培养的活化细胞有一定水平的ecm表达，因此通过在此基础上采用hmgb1作用于hsc作为刺激组，并设立相应的对照组观察ecm量的变化来说明问题。

我们研究证实随着hmgb1浓度的增加其促进hsc分泌ecm能力也相应增加，正常培养的hsc-t6细胞ecm分泌量较低,而经hmgb1刺激后hsc能分泌大量的p?

p,c?

。

在0.1mg/l～10mg/l范围内,hmgb1诱导hsc-t6分泌p?

p,c?

的量与hmgb1的浓度呈显著的剂量依赖性关系；hsc-t6ecm的分泌与时间关系显示：

hmgb1刺激组与无hmgb1刺激的对照组hsc-t6分泌ecm的量在0h～24h之间呈时间依赖性关系。

但对照组与刺激组相比,各相应时间点ecm的分泌量低于刺激组，在18h、24h两个时间点有显著差异。

上述研究结果进一步表明，即使传代培养的hsc作为具有活化生物学行为细胞，但在体外失去hmgb1刺激后，其分泌ecm的作用也逐渐减低。

因此，hmgb1在肝纤维化的发生发展过程中可能发挥重要作用。

【参考文献】

 ［１］friedmansl,molecularmechanismofhepaticfibrosisandprinciplesof,1997,32（3）:

424～430.

［２］helenaeh,ulfa.thenuclearproteinhmgb1asaproinflammatorymediator.［ｊ］.,2004,34（6）:

1503～1512.

［３］massimop,fabiom．cytokinereceptorsandsignalinginhepaticstellatecells．seminarinliverdisease，2001，21（3）：

397～416.

［４］liuxj,yangl,maoyq,etal.effectsofthetyrosineproteinkinaseinhibitorgenisteinontheproliferation,activationofculturedrathepaticstellatecells.worldjgastroenterol，2002,8（4）:

739～745.

［５］liuxj,yangl,wuhb,etal.apoptosisofrathepaticstellatecellsinducedbyantifocaladhesionkinaseantibody.worldjgastroenterol，2002,8（4）:

734～738.

［６］chengml,wuj,wanghq，etal.effectofmaotailiquorininducingmetallothioneinsandonhepaticstellatecells.worldjgastroenterol，2002,8（3）:

520～523.

［７］zhangxl,liul,jianghq.salviamiltiorrhizamonomerih764-3induceshepaticstellatecellapoptosisviacaspase-3activation.worldjgastroenterol，2002,8（3）:

515～519.

［８］yaoxx,tangyw,yaodm,etal.effectsofyigandecoctiononproliferationandapoptosisofhepaticstellatecells.worldjgastroenterol，2002,8（3）:

511～514.

［９］chenps,zhaiwr,zhouxm,etal.effectsofhypoxia,hyperoxiaontheregulationofexpressionandactivityofmatrixmetalloproteinase-2inhepaticstellatecells.worldjgastroenterol，2001,7（5）:

647～651.

［１０］wangjy,zhangqs,guojs,etal.effectsofglycyrrhetinicacidoncollagenmetabolismofhepaticstellatecellsatdifferentstagesofliverfibrosisinrats.worldjgastroenterol，2001,7

（1）:

115～119.

［１１］duwd,zhangye,zhaiwr,etal.dynamicchangesoftypeiiiiandivcollagensynthesisanddistributionofcollagen-producingcellsincarbontetrachlorideinducedratliverfibrosis.worldjgastroenterol，1999,5（5）:

397～403.

［１２］liuc,liup,liuch,etal.effectsoffuzhenghuayudecoctiononcollagensynthesisofculturedhepaticstellatecellshepatocytesandfibroblastsinrats.worldjgastroenterol，1998,4（6）:

548～549.

［１３］weihs,lidg,luhm,etal.effectsofat1receptorantagonist,losartan,onrathepaticfibrosisinducedbyccl4.worldjgastroenterol，2000,6（4）:

540～545.