hmgb1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响.docx

1、hmgb1对肝星状细胞细胞外基质合成的影响 作者：韩红莉 杨柳絮 吴红样 赵中夫【摘要】 目的：探讨高迁移率族蛋白b1（hmgb1）对肝星状细胞(hepatic stellate cell hsc)合成细胞外基质(extracellular matrix ecm)的影响。方法：剂量效应组分别用含hmgb1 0 mg/l,0.1 mg/l,1.0 mg/l,10 mg/l，20 mg/l和40 mg/l的hmgb1培养液培养hsc-t6 6 h；时间效应组以含有10 mg/l hmgb1的培养液培养0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,对照组以不含hmgb1的培养液分别培养hsc-t6细

2、胞，留取各组培养液离心后的上清，用双抗体夹心elisa方法检测其上清中p?p和c?的含量。结果：对照组hsc-t6细胞ecm分泌量较低；hsc-t6的ecm分泌量与hmgb1呈剂量依赖关系(r=0.835,0.955，p0.05)；10 mg/l hmgb1时间效应组的p?p,c?分泌量在18 h和24 h 均明显高于对照组（p0.05）。结论：hmgb1能诱导hsc-t6细胞分泌ecm，可能在肝纤维化的发生、发展中发挥重要作用。 【关键词】 hmgb1；hsc-t6；细胞外基质；肝纤维化 abstract objective:to investigate the effect of huma

3、n high mobility group box1 protein(hmgb1)on the extracellular matrix secretion of rat hepatic stellate cell and explore the function of hmgb1 in the occurrence and development of hepatic fibrosis.methods:the effects of various doses of hmgb1 on the ecm secretion of the hsc-t6 cells:cells were divide

4、d into six groups(0 mg/l,0.1 mg/l,1.0 mg/l,10 mg/l,20 mg/l,40 mg/l),each group cells were stimulated by different concentrations of hmgb1 for 6h;the relationship stimulated time of hmgb1 and secretion of ecm in hsc-t6 cells:cells were divided into control group and stimulated groups (0 h,6 h,12 h,18

5、 h,24 h,hmgb1 10 mg/l).the p?p and c? of culture supernatant were detected by elisa method.results:the secretion of ecm in the control groups was low, but it was obviously increased in the stimulated groups. and it was increased as time went on (0 h-24 h) and the secretion of ecm in stimulated group

6、s were obviously higher than in control groups at 18 h,24 h(p0.05).there was significantly dose-dependent relationship in 0.1 mg/l-10 mg/l scope(r=0.835,0.955，p0.05).conclusion:the secretion of ecm in hsc-t6 cell was induced by hmgb1 which could play an important role in the development of hepatic f

7、ibrosis. key words hmgb1;hsc-t6;ecm;hepatic fibrosis 目前认为，hsc的激活是肝纤维化发生发展的关键环节，hsc激活的始动因素是肝损伤和炎症反应，而hsc激活的过程包括早期启动激活和后期“持久化”激活，激活的“持久化”是维持hsc激活状态及产生ecm的必要条件。多种急性肝损伤因素虽能引发早期启动激活，但因为缺乏“持久化”激活因素，所以不会导致肝纤维化或肝硬化的发生（如hav/hbv引起的急性肝炎），而各种慢性感染或慢性炎症反应能持续激活hsc （如 hcv/hbv引起的慢性肝炎），因此，慢性炎症反应的持续存在是hsc激活“持久化”的基础。近年

8、来，随着对炎症反应认识的深入，人们发现了一种有效的炎症介质hmgb1,它具有较其他细胞因子释放晚和作用时间长的特点。那么hmgb1是否对肝纤维化的发生、发展发挥重要作用呢？我们课题组的先前研究表明在肝纤维大鼠的肝组织中hmgb1的表达明显增强，但hmgb1是否通过激活hsc参与肝纤维化的发生发展目前尚不清楚，本研究拟通过hmgb1刺激hsc以观察ecm的合成情况来进一步探讨hmgb1与肝纤维化的关系。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 hmgb1由本室制备保存；新生胎牛血清（fcs）为杭州四季青生物工程材料研究所产品；高糖型dmem购自英国gibco公司；大鼠p?p ，c?双抗体夹心elisa

9、检测试剂盒购自上海晶天生物科技有限公司（进口分装）；hsc-t6细胞株由北京地坛医院肝病研究所惠赠。 1.2 实验分组及处理 大鼠hsc-t6细胞系在含10%的胎牛血清的dmem培养基中培养传代4次至对数生长期,调整细胞数为2105密度接种于6孔培养板中,每孔1 ml,细胞贴壁后改用2%的胎牛血清的dmem培养液同步饥饿培养2 h,使培养细胞处于g0期后做下面实验： hmgb1的剂量效应组：分别用含有0 mg/l、0.1 mg/l、1.0 mg/l、10 mg/l 、20 mg/l和40 mg/l的hmgb1培养液培养hsc-t6，6 h后,收集hmgb1刺激孔及对照孔培养上清液，用双抗体夹心

10、elisa法测hsc-t6培养上清液中p?p，c?的含量。以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。 hmgb1的时间效应组：刺激组（10 mg/l hmgb1）和正常对照组（等量的pbs）分别用含10 mg/l hmgb1和等量的pbs的dmem培养液培养hsc-t6细胞0 h、6 h、12 h、18 h和24 h,同上收集培养上清液 用双抗体夹心elisa 方法测hsc-t6培养上清液中p?p ，c?的含量。以上每组均设3个复孔，具体操作严格按照试剂盒说明进行。 1.3 统计学方法 采用spss12.0统计软件，进行spearman相关分析，单因素anova(方差分析)，两样本

11、比较采用lsd-t检验，实验数据均以(xs)表示,p0.05判定有显著性差异。 2 结果 2.1. hmgb1对 hsc-t6分泌p?p、c?的剂量效应 hmgb1能促进hsc-t6分泌p?p、c?，在一定浓度范围内（0.1 mg/l10mg/l）呈剂量依赖关系（r=0.835，0.955，p0.05），当hmgb1浓度为10 mg/l时，hmgb1显著促进hsc-t6分泌p?p、c?并达峰值，当hmgb1浓度为20 mg/l时，hsc-t6 p?p、c?的分泌量与10 mg/l时相当，hmgb1浓度为40 mg/l时分泌量下降。（见表1)表1 不同剂量的hmgb1对hsc分泌ecm的影响2.

12、2. hmgb1对hsc-t6分泌p?p,c?的时间效应 刺激组hsc-t6分泌p?p、c?在0 h24 h间呈递增趋势,随着时间的延长增加,呈时间依赖关系(r=0.970，0.982，p0.05），但在18 h、24 h刺激组上清液p?p,c?含量明显高于正常对照组（p0.05）(见图1,图2)。 3 讨论 目前认为hsc在肝纤维化的进程中起重要的作用,在慢性损伤因素的持续作用下,肝脏内大量的细胞因子分泌，其中最主要的有tgf-、pdgf等，可以使静止的hsc活化、增殖，产生大量的细胞外基质(ecm)沉积于肝组织,由于其在肝纤维化中的特殊性地位。因此，体外培养hsc常作为肝硬化基础及实验治疗

13、研究的重要手段11 。一般认为，原代培养的hsc适用于研究相对静止的hsc生物学行为,而传代培养的hsc适用于研究活化的hsc生物学行为,本实验研究hsc的激活机制适宜选择静止状态的hsc，但原代hsc仅占肝脏非实质细胞数的5%10%，不管采用何种分离技术，最终得率很低。此外，原代培养的hsc细胞不甚稳定，细胞分离状况及培养条件对实验结果的影响较大，为克服上述缺陷，目前逐渐倾向以hsc系代替原代hsc作为研究的靶细胞，并已建立若干hsc系。本研究采用的hsc-t6细胞系是由大鼠肝星状细胞经过sv40病毒转染后形成的永生细胞系,具有无限传代的特性，是肝纤维化研究的良好模型。ecm过度沉积是肝纤维

14、化形成中关键的一步，ecm主要包括:(1)胶原:?型,?型, ?型、?型。(2)蛋白多糖:硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸等。(3)糖蛋白:层粘连蛋白、纤维连接蛋白、副层粘连蛋白、副纤维连接蛋白、粗纤维调节素。纤维化的肝脏含6倍于正常肝脏的胶原，其中?,?和?型胶原的含量显著增高。因此，检测ecm成分的含量常作为肝纤维化的辅助诊断手段13，目前认为p?p，c?,层粘连蛋白及透明质酸是最具代表性的肝纤维化血清学指标，因此在实验中我们采用体外培养的hsc作为研究的靶细胞,用elisa方法检测培养细胞上清液中p?p，c?的含量。本实验所用的hsc是经过传代培养的活化细胞有一定水平的ecm表达，因此通

15、过在此基础上采用hmgb1作用于hsc作为刺激组，并设立相应的对照组观察ecm量的变化来说明问题。我们研究证实随着hmgb1浓度的增加其促进hsc分泌ecm能力也相应增加，正常培养的hsc-t6细胞ecm分泌量较低,而经hmgb1刺激后hsc能分泌大量的p?p,c?。在0.1 mg/l10 mg/l范围内, hmgb1诱导hsc-t6分泌p?p,c?的量与hmgb1的浓度呈显著的剂量依赖性关系；hsc-t6 ecm的分泌与时间关系显示：hmgb1刺激组与无hmgb1刺激的对照组hsc-t6分泌ecm的量在0 h24 h之间呈时间依赖性关系。但对照组与刺激组相比,各相应时间点ecm的分泌量低于刺

16、激组，在18 h、24 h两个时间点有显著差异。上述研究结果进一步表明，即使传代培养的hsc作为具有活化生物学行为细胞，但在体外失去hmgb1刺激后，其分泌ecm的作用也逐渐减低。因此，hmgb1在肝纤维化的发生发展过程中可能发挥重要作用。【参考文献】 friedman sl, molecular mechanism of hepatic fibrosis and principles of ,1997,32(3):424430. helena eh, ulf a. the nuclear protein hmgb1 as a proinflammatory mediator.,2004,34

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