活性氧与耳蜗钾通道的研究进展.docx

活性氧与耳蜗钾通道的研究进展.docx

《活性氧与耳蜗钾通道的研究进展.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《活性氧与耳蜗钾通道的研究进展.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

活性氧与耳蜗钾通道的研究进展

活性氧与耳蜗钾通道的研究进展

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

【摘要】　　活性氧（氧自由基）学说是机体衰老的主要机制之一，活性氧在衰老进程中所起作用得到重视。

本文主要针对年龄相关性听力下降发病机制中的活性氧与耳蜗钾通道相互影响的研究进展进行综述。

【关键词】活性氧耳蜗钾通道

　　由于膜片钳技术和分子生物学实验研究方法的进步，经过对耳蜗钾通道蛋白基因的克隆、组装、突变、异体表达及与天然通道功能的比较等研究，目前己对耳蜗钾通道的分子结构、电生理学特性、药理特性以及病理机制等都有了较全面而深入的了解。

伴随社会老龄化的进程，年龄相关性听力损失（Age-relatedhearingloss，ARHL）的问题日益突出，对患者身心健康产生极大的影响.严重影响了他们的生活质量。

目前认为与体内活性氧的产生、清除、利用的失调及其对内耳离子通道的损害有关。

　　1耳蜗钾通道的生物学特性

　　1.1钾通道的分子生物学基础、分型及其生理功能在离子通道中，K+通道是最庞大的家族，也是临床与科研的热点领域。

目前有关K+通道及其多级亚型的命名与分类仅哺乳类生物即多达50余种，且仍不断出现新的命名，较其他离子通道具有更多的结构、类别与功能。

K+通道主要由4个shaker糖蛋白（4个亚单位）构成，相互间有高度同源性。

根据不同生物，sbaker亚单位蛋白可为shab、shaw或shal亚单位蛋白，但通道亚单位四者只居其一，不能相互结合。

每个亚单位蛋白迂回跨越细胞膜6次，即具有6个跨膜段，分别命名为S1～S6区。

此系离子通道发挥作用的功能区段之一，每个通道拥有4个如此重复的成分；在S4区的氨基酸残基带正电荷，对膜电位变化敏感，膜去极化时，带电荷的氨基酸发生电荷移动，分子重新排列，引起结构改变，传递给功能区以开放离子通道；当其自行移动时，则产生微弱的门控电流。

此系所有电压——门控型离子通道分子结构的共同特点。

Ca2+激活型K+通道（Kca）虽非电压一-门控型，但可具有此特点［1］。

而内向整流型K通道（Kir）具有独特的电生理学特点，其H5区为一狭窄或倒立锥形结构，从内可被MS与多胺化合物阻滞，如精胺、亚精胺，可允许K＋自由进入细胞内，而限制其出路［2］。

Yost与Patel等［1,3］学者建议，应根据此离子通道的分子结构，最重要的细胞生理学特点，兼顾不同生物种类发现K＋通道的研究历史，相对统一、标准地分类为电压——门控型（voltage-gatedK＋channels,Kv）、Ca2+激活型（Ca2+-activeK+channels,KCa）、内向整流型（inwardrectifierK+channels,Kir）和双P区型4大类。

钾通道在处理神经递质释放、心脏节律、胰岛素分泌、神经元兴奋、上皮电解质传输、平滑肌细胞调节和细胞体积调节等细胞信号方面起着重要作用。

　　1.2钾通道对耳蜗听功能的影响目前，在哺乳动物耳蜗中发现许多与听功能有关的钾通道蛋白，比如TASK-1［4］、TREK-1［4］、NKCC1［5］、KCNQ15［6、7］、KCNJ10［8］、KCNE1［8］和Kir2.1［9］。

国内外研究表明，这些K＋通道在听觉形成过程中发挥着关键作用，其主要的生理功能有调节毛细胞和神经元细胞的膜电位并维持其电兴奋性;参与毛细胞的突触前抑制;维持内淋巴电位（endocochlearpotential，EP）;参与耳蜗中K+循环等。

哺乳动物耳蜗中内淋巴液高钾低钠的离子环境和+80mV的内淋巴电位与正常毛细胞内环境间建立了一个很大的电化学势能差，这在毛细胞的声音感受过程中起重要的作用。

外界声音刺激引起毛细胞顶部纤毛偏移，机械门控性阳离子通道开放，内淋巴液中的阳离子循电化学势能差进入毛细胞，产生去极化，激活电压依赖性钙通道，胞外Ca2+内流并引起毛细胞底部神经递质的释放，完成声音从机械能到电能的转换。

在此过程中，毛细胞内高浓度的K+经底侧膜钾通道流入外淋巴液，外淋巴液中的K+被相邻支持细胞摄取，再经缝隙连接进入血管纹，最终K+由缘细胞分泌回内淋巴液，得以维持内淋巴液中离子环境稳态，故内耳K+循环在正常听觉形成过程中起十分关键的作用［10］。

　　这一独特的循环通路上离子通道的缺陷必将导致耳聋，由这部分离子通道功能改变引起的耳聋亦属于离子通道病范畴。

RüttigerL等发现大电导Ca2+激活钾通道（BK）在耳蜗内毛细胞信号转导中起重要作用。

BK通道由α亚单位和β亚单位构成。

分别测定BK通道BKα-/-和BKβ-/-编码基因敲除小鼠的听功能和耳蜗表型，证实BKβ-/-小鼠的听功能和耳蜗结构正常，而BKα-/-小鼠在生后前四周几乎无明显听力障碍，生后第八周起BKα-/-小鼠出现高频听力损失，伴畸变产物耳声发射的减弱，外毛细胞功能障碍，提示人类BK编码slol基因突变造成BK功能障碍成为渐进性耳聋的一个易感因素［11］。

RivasA等发现先天性耳聋伴心脏传导异常（JervellandLange-Nielsen综合征）与KCNQ1/KCNE1通道复合物的功能障碍有关。

给予短纯音刺激，记录听性脑干反应检测出的三只KCNQ1编码基因敲除小鼠、两只杂合子小鼠、一只野生型小鼠的听阈，再取出颞骨行组织病理切片检查，KCNQ1编码基因敲除小鼠出现耳聋，切片显示明显的血管纹萎缩，内淋巴液管道挛缩，外层膜萎缩、粘连，Corti器和相应螺旋神经节完全变性，与已报道的人类JervellandLange-Nielsen综合征患者的组织病理学特点一致［12］。

MazurekB等将新生大鼠Corti器的组织培养物分别暴露于模拟含氧量正常和局部缺血条件下K＋浓度为5～70mM的人工外淋巴液中3～4小时，再于24小时后为耳蜗毛细胞计数，发现

（1）模拟氧化量正常条件下胞外K＋30-70mM浓度对毛细胞没有影响；

（2）模拟局部缺血条件下，胞外高K+浓度下，毛细胞的损失比预计减轻很多，而使用KCNQ4通道阻滞剂利诺吡啶后，上述效应几乎消失。

推测KCNQ4通道是毛细胞在局部缺血和去极化条件下存活的关键因素之一［13］。

KnipperM等发现溶酶体膜蛋白LIMP2-缺陷小鼠在四周龄出现渐进的高频听力损失和耳声发射的减弱，同时荧光免疫组织化学检查几乎不能在耳蜗血管纹边缘细胞的腔面以及前庭系统暗细胞检测到KCNQ1及其β亚单位KCNE1。

推测在膜转运胞内吞途径中起关键调节作用的LIMP2的缺陷首先会导致KCNQ1/KCNE1的缺失，数月后出现结构改变，从而造成听力损失［14］。

褚汉启等揭示了NKCC1在耳蜗钾循环和维持EP中的重要作用，NKCC1的缺乏可以导致K＋在边缘细胞处转运入内淋巴液受阻，主要由K＋构成的EP下降甚至消失，导致在声音的机械——电转导过程中K＋进入毛细胞的驱动力下降，毛细胞去极化的程度降低，神经递质的释放受到影响而造成听力损失［5］。

褚汉启等跟踪检测α2Na，K-ATPase+/+野生型小鼠和α2Na，K-ATPase+/-杂合子小鼠的听力时发现，α2Na，K-ATPase+/-小鼠的听功能和EP数值明显低于α2Na，K-ATPase+/+小鼠，α2Na，K-ATPase+/-小鼠的听力有随年龄增加而下降的趋势，认为随年龄增长其耳蜗侧壁血管纹出现萎缩，使得Na，K-ATPase活性和主动转运K＋的功能下降，部分阻碍了内耳K＋循环，致内淋巴液K＋浓度下降而使EP相应下降，因此可能在年龄相关性听力下降发病中起作用［15］。

Pendred综合征，一组常见的以先天性耳聋和甲状腺肿为特征的常染色体隐性遗传病症，是由编码pendrin蛋白的Slc26a4基因突变导致的。

WangemannP用Slc26a4+/+和Slc26a4-/-小鼠研究pendrin和耳聋的关系，发现Slc26a4-/-小鼠缺乏位于中间细胞的钾通道KCNJ10产生的横跨基底细胞层的耳蜗内电位，而基底细胞层完整，中间细胞和KCNJ10mRNA存在，但是KCNJ10蛋白缺乏，内淋巴液中K＋浓度正常，K+分泌必需的膜电位存在，钾通道KCNQ1、KCNE1、Na+/2Cl-/K+协同转运蛋白SLC12A2和隙缝连接GJB2等都存在。

推测pendrin蛋白的失调导致KCNJ10蛋白表达的缺失和耳蜗内电位的消失，从而可能是Pendred综合征的直接原因［8］。

　　2活性氧的生物学特性

　　2.1活性氧的概述活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS），也称氧自由基，是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称，包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH-）、一氧化氮（NO）等。

超氧阴离子是一种重要的R0S，它由氧分子接受一个电子而形成。

O2在水溶液中易发生歧化反应生成H2Ｏ2，在酸性环境中高浓度O2的质子化产物HO2-更易发生此反应。

因此在生理条件下，一旦形成超氧化物自由基，过氧化氢必然产生。

与O2不同，H2Ｏ2是一种更稳定的分子。

在一般情况下，生物体内产生的H2Ｏ2常被抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶（GSSGR）和低分子量抗氧化剂如谷胱甘肽、血浆蛋白清除，如果得不到及时清除，它可透过细胞膜，若膜外有Fe2+或Cu+等金属离子存在时可生成HO-。

羟自由基是化学性质最活泼的活性氧，有很强的氧化作用，寿命极短，可与周围的生物分子反应，产生不同反应性的二级自由基［16］。

所以活性氧之间在一定条件下是可相互转变的。

正常情况下，人体内有l%～2%的氧接受一个电子，成为ROS，在线粒体内的超氧歧化酶（SOD）作用下，将O2-变成氧化能力弱的H2O2。

H2O2在CAT和GSH过氧化氢酶的作用下变成水。

脂类过氧化物也可经GSH过氧化物酶清除。

故在正常健康人体，ROS的产生与SOD、CAT等内源性清除机制维持平衡。

其中SOD构成清除ROS的第一道防线，触酶和GSH构成第二道防线。

　　2.2活性氧对耳蜗听功能的影响随着年龄的增加，耳蜗组织的供应血管逐渐弹性降低，管壁增厚，管腔狭窄，毛细血管减少，血液黏度逐渐升高，红细胞变形能力下降。

由此，耳蜗的血流减少，血液瘀滞，微血栓形成，血管纹萎缩，氧气与营养物质的运送减少，废物的排出也减少。

局部组织缺血缺氧，然后是血管扩张，血流再灌注，导致再灌注性损伤，同时长时间的能量需求，导致抗氧化酶的过度消耗，大量的ROS积聚。

线粒体中的脂类过氧化作用增强伴随蛋白质氧化修饰，增加了基因突变和线粒体DNA的氧化损伤。

有缺陷线粒体DNA编码的蛋白质亚单位的呼吸酶产生的ROS进一步增加。

这一过程是通过电子传递链中电子泄漏增加产生的。

而耳蜗组织却很少或几乎没有细胞更新，从而直接损伤耳蜗组织，还造成毛细胞DNA的损伤，加速细胞凋亡，导致从听觉器官到听中枢细胞的结构和功能的广泛损害。

　　赖丹、黎万荣等发现外毛细胞、内毛细胞在H2O2作用下可直接出现细胞变性、坏死，复合动作电位阈值升高，虽然螺旋节神经细胞未见损伤，考虑其髓鞘内富含不饱和脂肪酸，推测可能成为H2O2介导的脂质过氧化反应的靶细胞［17］。

KeithleyEM等研究Cu/Zn超氧化物歧化酶ARHL失的关系，通过对SOD1转基因小鼠年龄、基因的配对控制，培养了SOD1缺失和耳蜗过度表达SOD1的两种SOD1无效小鼠。

通过听性脑干反应（ABR）和耳蜗组织学的检查，发现SOD1缺失小鼠听力损失的发生时间比野生、杂交型早，SOD1无效小鼠的耳蜗在7～9月龄出现严重的螺旋神经节细胞的变性，老龄、无效小鼠的血管纹比杂交、野生型小鼠的细。

除了24月龄，SOD1过度表达也不能避免听力损失。

推测抗氧化酶类如Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）保护细胞免于活性氧损伤，活性氧类参与了年龄相关性变性［18］。

RivaC等通过CD/1小鼠研究串联“HIF-ROS”机制与ARHL的关系。

分别在CD/1小鼠4，12和24周龄测定听功能，最后逐一分析耳蜗。

证实CD/1小鼠在12周龄出现特征性ARHL改变。

第4周监测到耳蜗有强烈的HIF-1α表达，第12周ROS形成，可能导致耳蜗变性和诱导CD/1小鼠模型ARHL的发病。

第4，12周，耳蜗的内毛细胞、外毛细胞保持完整，螺旋神经节细胞开始改变，而螺旋神经节的雪旺细胞似乎对自由基的损伤比神经元更脆弱，并且变性很快。

推测螺旋神经节细胞变性的机制包括了细胞凋亡蛋白酶和Bax介导的经由P53蛋白积累的细胞程序死亡。

缺氧期间HIF-α翻译后的稳定存在会促使更多的活性氧生成，而窜联的“HIF-ROS”介导了耳蜗的多种反应，如伴随肿瘤坏死因子-α的表达增加和抑制胰岛素样生长因子-1的神经保护机制等强烈的炎症反应［19］。

JiangH等研究老龄CBA/J小鼠耳蜗内的氧化应激情况。

谷胱甘肽结合蛋白标记H2O2介导的氧化，在12月龄的开始增加。

在螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带的支持细胞（Deiters和pillar细胞）里的标记物的免疫反应性比感觉细胞表现得更强、更晚。

相反，Corti器（包括感觉细胞）和螺旋神经节细胞的抗氧化蛋白（AIF）和酶（SOD2）在18月龄时减少。

提示在老龄耳蜗不同组织存在不同的活性氧物质和不同的氧化改变进程。

氧化还原状态的失衡可能参与促进ARHL［20］。

　　3活性氧影响耳蜗钾通道的机制

　　ROS对生物大分子有很强的损伤作用，可直接损伤细胞膜，使胞膜磷脂结构内多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，DNA分子的碱基降解，氢键破坏，核酸主链断裂，蛋白质分子的交联聚合和肽键的破坏，以及粘多糖、胶原和弹性纤维的破坏，造成一系列细胞的功能紊乱。

特别是线粒体，氧的利用率高，是ROS的重要来源。

而线粒体DNA缺乏保护蛋白及修复能力。

因而最易受攻击，可经脂过氧化反应生成强力交联剂丙二醛，DNA发生交联或断裂失活。

膜脂过氧化还会影响膜流动性、通透性和完整性。

从而直接破坏耳蜗钾通道蛋白的分子结构，并干扰耳蜗钾通道的电生理功能及其编码基因的转录、翻译、修饰等生理活性。

　　赖丹、黎万荣等在尼福地平对过氧化氢致听力损失的拮抗作用的实验中发现，灌流H2O2对耳蜗功能有抑制，致复合动作电位阈值升高和耳蜗微音电位（cochlearmicrophonic，CM）相对幅度降低。

形态学发现内、外毛细胞均有损伤，外毛细胞损伤最重，为H2O2攻击的主要靶细胞，而内毛细胞损伤稍轻。

尼福地平作为L-型钙通道阻断剂可部分拮抗H2O2所致的听力损失。

推测可能是ROS使钙通道被激活，胞外Ca2+内流人胞内，少量Ca2+升高即可激活Ca2+依赖性K+通道，引起外毛细胞膜去极化和OHC快运动，继发引起大量Ca2+内流，导致CM幅度逐渐下降，从而证实活性氧也可间接影响耳蜗K+通道的听功能［17］。

pendred综合征是由于编码HCO（3）（-）运载体pendrin的Slc26a4基因突变造成的。

pendrin的缺失造成血管纹K+通道KCNJ10缺失，进而引起耳蜗内电位消失并形成耳聋。

SinghR等指出自由基应激在KCNJ10、pendrin的先后缺失间存在联系。

研究使用本地培养的Slc26a4（+/-）和Slc26a4（-/-）小鼠的血管纹及中国仓鼠卵巢（CHO）-K1细胞。

发现生后第10天，Slc26a4（+/-）andSlc26a4（-/-）小鼠的血管纹表达接近等量的KCNJ10。

Slc26a4（-/-）小鼠在接着5天的发育中缺乏KCNJ10的表达。

相反，从生后10天Slc26a4（-/-）小鼠获得的血管纹，继续培养5天，却保持KCNJ10的表达。

Slc26a4（-/-）小鼠的血管纹被发现遭受活性氧应激破坏，并得到蛋白质被氧化、硝化量增多及蛋白质、基因表达的其它改变所证实。

药物引发的活性氧应激足够引起CHO-K1细胞的KCNJ10表达减少。

推测Pendred综合征患者可能有活性氧应激破坏KCNJ10参与耳聋的发病［21］。

　　4抗氧化剂的应用

　　目前应用多种抗氧化剂如酶类、维生素类、微量元素、中草药提取物等，以捕获耳蜗ROS，阻断ROS的链式反应，保护胞膜免受攻击，维护胞膜的完整性、稳定性和通透性，并提高SOD、CAT和GSH过氧化物酶活性，从而减轻ROS对耳蜗钾通道蛋白及其编码基因的破坏。

　　王利一等应用长期维生素C治疗对大鼠听阈影响的实验中证实VitC可延缓老年性聋的发展。

推测可能是VitC使氧化型谷胱甘肽还原,使还原型谷胱甘肽不断得到补充。

因此,VitC借助谷胱甘肽在体内发挥抗氧化作用，保护ROS对mtDNA损伤的作用［22］。

袁逸铭等给自然衰老模型大鼠灌胃分别予太子参醇提物（EPHPH）2.16、4.32及8.64g/kg·d，每日1次，共6个月，测定自然衰老模型大鼠听性脑干反应（ABR）及耳蜗组织中丙二醛（MDA）、SOD、一氧化氮合酶（NOS）及分型一氧化氮合酶（iNOS）。

发现自然衰老模型大鼠ABR阈值明显升高，并伴有耳蜗组织中MDA明显升高，SOD、NOS及iNOS活力明显下降。

相关性分析表明，ABR阈值升高与耳蜗组织中MDA升高呈正相关；与SOD、NOS及iNOS活力明显下降均呈负相关。

自然衰老模型大鼠予太子参醇提物2.16、4.32及8.64g/kg·d灌胃的，能不同程度对抗ABR阈值升高及耳蜗组织中MDA升高，其量效关系呈负相关；能不同程度抑制SOD、NOS和iNOS活力降低，其量效关系均呈正相关。

推测EPHPH可能清除耳蜗组织中氧自由基，提高SOD及NOS活力，并可减轻老年性聋程度［23］。

葛圣雷等腹腔注射D-半乳糖建立大鼠衰老动物模型,以腹腔注射生理盐水为阴性对照,检测ABR，明确衰老动物听力减退情况,检测大鼠耳蜗组织MDA含量和超氧化物歧化酶SOD活性;并观察胃内灌注儿茶素后上述指标的变化。

发现衰老模型组大鼠与对照组大鼠相比较,ABR阈值增高,MDA含量明显增高,SOD活性明显降低；儿茶素组MDA含量和SOD活性水平较对照组无变化,而与衰老模型组相比却逆转上述指标变化,并能提高听力。

推测儿茶素可能通过提高SOD活性、减少MDA生成发挥清除活性氧,从而改善听觉功能［24］。

TakumidaM等让46名年龄相关性听力损失的老年病人口服雷米巴特（300mg/天）、α硫辛酸（60mg/天）、维生素C（600mg/天）至少8周后，检测发现所有频率的听力级均提高，提示氧自由基清除剂治疗可能成为ARHL新的有效的治疗方法［25］。

　　综上所述，活性氧对以钾通道为代表的耳蜗离子通道有非常重要的作用，随着研究的深入，将有助于揭示ARHL的发病机制，并为预防、治疗ARHL提供理论和方案。

【参考文献】

　　［１］YostCS．Potassiumchannels:

basicaspects,functionalroles,andmedicalsignificance［J］．Anesthesiology,1999,90（4）:

1186～1203．

　　［2］RuppersbergJP．IntracellularregulationofinwardrectifierK+channels［J］．PflugersArch，2000,441

（1）:

1～１1．

　　［3］PatelAJ，Honore’E．Anesthetic-sensitive2PdomainK+channels［J］．Anesthesiology,2001,95（4）:

1013～1021．

　　［4］KanjhanR,BalkeCL,HousleyGD，etal．Developmentalexpressionoftwo-poredomainK＋channels,TASK-1andTREK-1,intheratcochlea［J］．Neuroreport,2004,15（3）:

437～441．

　　［5］褚汉启，黄孝文，熊浩，等．Na-K-2Cl联合转运子-1和α2Na,K-ATP酶在耳蜗钾离子循环中的作用及与听觉功能的关系［J］．中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006,41（9）:

692～697．

　　［6］LiangGH,JinZ,UlfendahlM，etal．MolecularanalysesofKCNQ1-5potassiumchannelmRNAsinratandguineapiginnerears:

expression,cloning,andalternativesplicing［J］．ActaOtolaryngol,2006,126（4）:

346～352．

　　［7］JinZ,LiangGH,CooperEC,etal．ExpressionandlocalizationofKchannelsKCNQ2andKCNQ3inthemammaliancochlea［J］．AudiolNeurootol,2009,14

（2）:

98～105．

　　［8］WangemannP,ItzaEM,AlbrechtB，etal．LossofKCNJ10proteinexpressionabolishesendocochlearpotentialandcausesdeafnessinPendredsyndromemousemodel［J］．AmJPhysiolRenalPhysiol,2008,294

（1）:

139～148．

　　［9］RuanQ,ChenD,WangZ,etal．TopologicalanddevelopmentalexpressiongradientsofKir2．1,aninwardrectifierK+channel,inspiralganglionandcochlearhaircellsofmouseinnerear［J］．DevNeurosci,2008,30（6）:

374～388．

　　［10］WangemannP．K＋cyclingandtheendocochlearpotential［J］．HearRes,2002,165（1-2）:

1～9．

　　［11］RüttigerL,SausbierM,ZimmermannU,etal．DeletionoftheCa2+-activatedpotassium（BK）alpha-subunitbutnottheBKbeta1-subunitleadstoprogressivehearingloss［J］．ProcNatlAcadSciUSA,2004,101（35）:

12922～12927．

　　［12］RivasA,FrancisHW．InnerearabnormalitiesinaKcnq1（Kvlqt1）knockoutmouse:

amodelofJervellandLange-Nielsensyndrome［J］．OtolNeurotol,2005,26（3）:

415～424．

　　［13］MazurekB,AmarjargalN,HauptH，etal．Highpotassiumconcentrationsprotectinnerandouterhaircells