白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多态性与进化.docx

白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多态性与进化.docx

《白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多态性与进化.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多态性与进化.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多态性与进化

白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多

态性与进化

李力1,罗斯特1,林清贤1,2*,陈小麟1,2*

（1.厦门大学生命科学学院,2.厦门大学环境与生态学院,滨海湿地生态系统教育部重

点实验室,福建厦门361102）

摘要:

克隆测序白鹭（Egrettagarzetta）5个种群138份个体组织样本的主要组织相容性复合体（MHC）II类B基因（DABI）第2外显子（exon2）序列,分析探讨第2外显子基因的多态性、进化选择、系统关系和种群遗传结构.主要结果如下:

白鹭MHCIIDABI第2外显子基因序列长度为270bp,共计定义了139个等位基因;序列分析显示第2外显子基因有101个核苷酸变异位点（37.4%）和31个氨基酸变异位点（34.4%）;基于贝叶斯法构建的系统树显示白鹭MHCIIDABI第2外显子基因有5个高支持率的谱系;肽结合位点（PBR）、非肽结合位点（non-PBR）的非同义替换率（dN）和同义替换率（dS）比值计算显示,PBR的dN/dS为1.99（p<0.05）,而non-PBR的dN/dS则小于1,表明白鹭MHCIIDABI第2外显子基因受到正选择作用;根据等位基因在群体中的分布频率作分子方差分析（AMOVA）,得到FST为0.1941（p<0.0001）,提示白鹭MHCIIDABI第2外显子基因存在显著的种群遗传结构分化.关键词:

白鹭;主要组织相容性复合体;遗传变异;进化;系统关系;种群结构

中图分类号:

Q958;Q953文献标志码:

A

主要组织相容性复合体（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）是一类与免疫密切相关的基因家族,它广泛存在于脊椎动物体内,在机体免疫和自身免疫耐受的形成过程中起着重要的作用[1-3].MHC在脊椎动物体内负责编码细胞表面糖蛋白,调节免疫系统识别本体和异物.当抗原进入机体后,MHC分子可与之结合而被T细胞受体识别,进而激发机体产生特异性免疫反应[4-6].根据其化学结构和功能差异及编码蛋白种类的不同,MHC分为3大类:

MHCI、MHCII、MHCIII.目前在保护遗传学中的研究主要对象为MHCI类和MHCII类分子[5].MHCI类和MHCII类分子具有相似的结构,都是非共价结合的异源双链分子,包含α链和β链,具有4个胞外结构域,但结构域的组成有所不同[7,8].MHCI类分子所编码的基因

收稿日期:

2015-04-16

基金项目:

国家自然科学基金（41476113,31272333）;福建省自然科学基金（2010Y2007）.

*通信作者:

lqx@（林清贤）;xlchen@（陈小麟）

1

在真核细胞中表达,主要功能是递呈内源性抗原（主要是病毒）到CD8+细胞毒性T细胞以激发免疫反应[7].MHCII类分子所编码基因主要负责将经过加工的外源性抗原（主要是细菌）呈递给辅助性T细胞的抗原受体（TCR）,激活和分化辅助性T细胞,从而诱发免疫应答,是脊椎动物应对细胞外环境病源的主要方式[9,10].MHC具有丰富的多态性,其多态性最丰富的是MHCII类基因,主要为β链基因（B基因）,包括β1（DABI）和β2（DABII）均具有高度多态性,特别是其负责编码抗原结合区域的第2外显子（exon2）是目前公认的研究抗病标记和遗传育种的重要基因[11,12].由于不同外源病原会诱发MHC产生相应的变化,因此MHC变异能够反映种群内、种群间受到自然选择压力时所产生的适应性,适合用于研究进化生态学和保护遗传学方面的科学问题[13-15].有关鸟类MHC的研究,自Kaufman等报道了鸡（Gallusgallus）的MHC全基因序列以来,目前已对多种鸟类的MHC基因进行了深入的研究,包括朱鹳（NipponiaNippon）、白腰叉尾雨燕（Oceanodromaleucorhoa）、日本鹌鹑（Coturnixjaponica）、蓝冠山雀（Cyanistescaeruleus）、黑琴鸡（Tetraotetrix）、小斑几维鸟（Apteryxowenii）、小绿鹎（Andropadusvirens）等[16-23].鸟类MHC的早期研究主要侧重于分析MHC分子结构和应用于物种进化等方面,近年来则倾向于MHC基因的多态性与群体遗传学的研究.

白鹭（Egrettagarzetta）是鹭科白鹭属的鸟类,为全球性分布的水鸟[24].近年来关于白鹭的研究,主要集中在其野外生活习性和系统分类地位,而有关白鹭群体遗传学的研究则少见报导[25-27].作为广布种,野外白鹭种群在不同生境下面对各不相同的环境条件,因此受到侵扰的病源也会有所差异,由此可能产生不同的免疫应答反应,进而引起MHC基因水平的差异.因此,本研究将通过分析白鹭不同地理种群的MHC遗传多样性水平差异,探讨自然选择压力对白鹭MHC种群遗传结构的影响,以便更好地理解白鹭MHC遗传多样性的进化机制,完善鸟类适应性进化理论.

1材料与方法

1.1材料

共取得白鹭个体血液和羽毛组织样品138份,分别采自福建宁德日屿（RY:

28）、福建厦门鸡屿（JY:

30）、河南信阳（XY:

30）、浙江舟山（ZS:

30）和贵州遵义南白（NB:

30）5个地理种群,所有样品均通过无损伤性取样方法从野外自然繁殖种群个体中获取.

1.2基因组DNA提取和PCR扩增

采用EasyPureGenomicDNAkit（北京全式金生物公司）提取基因组DNA,PCR采用Li（2011）所设计的引物,引物序列如下:

ARB2EN1（5'-ACYKKCCYCCCTGCACAAACAGGG-3'）,ARB2EC（5'-CCCCAGGGARATGTTCTGCCACGC-3'）,以扩增MHCIIDABI第2外显子序列[28].PCR反应在C1000TMThermalCycle（Bio-RAD）PCR仪完成,反应总体系为25μL,其中包括10XPCRBuffer、DNA模板30~50ng、0.2mmol/LdNTP、引物各20umol/L、1UTaqDNA聚合酶（TaKaRa）,设不含模板的空白对照.PCR扩增反应循环条件为:

94℃预变性5min;94℃变性1min,58℃退火30s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸1

0min.

1.3SSCP电泳

通过单链DNA多态性分析方法（Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）筛选不同的等位基因用于分析[29].操作过程如下:

将已纯化的PCR产物10μL混合等体积的变性缓冲液（体积分数95%的去离子甲酰胺、10mmol/LNaOH、20mmol/LEDTA和0.2g/L溴酚蓝及0.2g/L二甲苯菁）,99℃加热10min后迅速冰浴,以维持DNA单链状态.将变性后的DNA置于体积分数8%的聚丙酰胺凝胶中,在4℃、260V条件下电泳19h后银染干燥.回收纯化所有认为存在区别的条带并作为二次PCR扩增的模板,以1.2的PCR反应体系和条件进行扩增.

1.4克隆及测序

将PCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离,用胶回收试剂盒（Omegacat#:

D2500-02）纯化目的片段.将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T载体（TaKaRa）,再将重组质粒转入大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α菌株（TaKaRa）,在含有氨苄青霉素LB平板上进行涂板,37℃培养箱中培养16h.通过蓝白斑筛选和菌落PCR法筛选阳性克隆.从每个样品挑选5~8个阳性克隆,所有克隆均采用载体通用测序引物M13,在上海美吉生物完成测序.

1.5数据分析

使用软件LasergeneSeqManPro7.1.0拼接校对测序结果,根据判别外显子-内含子的GU-AG法则,并参照黄嘴白鹭MHC序列（GenBank:

KC282867.1）,再用推导的氨基酸序列在GenBank上作BLAST检索来确定是否为MHC序列.使用MEGA6.0软件对外显子氨基酸序列进行序列比对,分别计算外显子核苷酸和氨基酸的变异位点数,等位基因间的p遗传距离和平均遗传距离,用于评估外显子的变异程度[30].从GenBank数据库上下载3种鹭科鸟类MHC

IIB基因exon2序列,包括黄嘴白鹭（Egrettaeulophotes,HM991028.1）、岩鹭（Egrettasacra,HM991087.1）、夜鹭（Nycticoraxnycticorax,HM991040.1）.基于这些序列利用MrBayes3.2.3软件,构建贝叶斯树（Bayesianinference）,Iset设置替代模型为nst=6（GTRmodel）,位点速度变异模型为rates=gamma（Gammadistribution）.设Nchains=4,建立马尔科夫链,mcmcngen=2×107,每1000代抽样一次,将抽样的25%划为老化样本并舍去,计算相关参数,以后验概率（posteriorprobabilityvalue）评估系统树各分支的置信度[31].

根据等位基因在各个群体的分布频率,用Arlequin3.1软件计算群体间分子方差（analysisofmolecularvariance,AMOVA）以检验群体间的遗传结构[32].利用PAML4.0软件包中的CODEML程序检测氨基酸水平上受到的选择压力[33].该软件根据选择参数ω（ω=dN/dS）的大小,推测目标序列是否经受选择压力,如果ω显著大于1,则表明存在正选择作用[33].本文主要比较数据组在模型M1与M2,M7与M8之间的差异.同时根据贝叶斯经验贝叶斯路径（BayesEmpiricalBayes,BEB）检测受到正选择作用的氨基酸位点[34,35].

2结果

2.1MHCIIDABIexon2的基因序列测定

本研究共计对白鹭138个个体样本的630个阳性克隆进行了测序与分析,所得序列经NCBI中BLAST同源比对,检索后确定为MHCDABIexon2基因片断.每条序列只有在2个或2个以上克隆序列完全一致时才被认定是可靠的序列,用于后续的分析[36].所得MHCDABIexon2核苷酸序列长度为270bp,共定义139个等位基因,命名为Egrgat-DAB001~Egrgat-DAB139（图1）.

2.2MHCIIDABIexon2的多态性

139个等位基因经比对排列后,没有发现插入（缺失）或终止密码子.核苷酸序列变异位点的比例为37.4%（101/270）,对应的氨基酸序列变异位点的比例为34.4%（31/90）.等位基因间核苷酸位点的变异范围为12~28个碱基,氨基酸位点的变异范围为3~14个位点.

Fig.1Variablenucleotidesitesamong139MHCIIDABIexon2allelesinlittleegret

2.3MHCIIDABIexon2的选择压力检测

MHCII分子直接与抗原多肽结合的氨基酸残基称为肽结合位点（peptidebindingresidues,PBR）.肽结合位点由于与抗原多样性的相互作用,序列变异较大,当非同义替换率（dN）/同义替换率（dS）