白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多态性与进化.docx

1、白鹭MHCIIDABI第二外显子基因的多态性与进化白鹭MHC II DAB I第二外显子基因的多 态性与进化 李力1,罗斯特1,林清贤1,2*,陈小麟1,2 * (1.厦门大学生命科学学院,2.厦门大学环境与生态学院,滨海湿地生态系统教育部重 点实验室,福建厦门361102) 摘要:克隆测序白鹭(Egretta garzetta)5个种群138份个体组织样本的主要组织相容性复合体(MHC)II类B基因(DAB I)第2外显子(exon2)序列,分析探讨第2外显子基因的多态性、进化选择、系统关系和种群遗传结构. 主要结果如下:白鹭MHC II DAB I 第2外显子基因序列长度为270 bp,共

2、计定义了139个等位基因;序列分析显示第2外显子基因有101个核苷酸变异位点(37.4%)和31个氨基酸变异位点(34.4%);基于贝叶斯法构建的系统树显示白鹭MHC II DAB I 第2外显子基因有5个高支持率的谱系;肽结合位点(PBR)、非肽结合位点(non-PBR)的非同义替换率(d N) 和同义替换率(d S)比值计算显示,PBR的d N/d S为1.99 (p0.05),而non-PBR的d N/d S则小于1,表明白鹭MHC II DAB I第2外显子基因受到正选择作用;根据等位基因在群体中的分布频率作分子方差分析(AMOVA),得到F ST为0.1941(p0.0001),提示

3、白鹭MHC II DAB I第2外显子基因存在显著的种群遗传结构分化. 关键词:白鹭;主要组织相容性复合体;遗传变异;进化;系统关系;种群结构 中图分类号: Q 958;Q 953 文献标志码: A 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是一类与免疫密切相关的基因家族,它广泛存在于脊椎动物体内,在机体免疫和自身免疫耐受的形成过程中起着重要的作用1-3. MHC在脊椎动物体内负责编码细胞表面糖蛋白,调节免疫系统识别本体和异物.当抗原进入机体后,MHC分子可与之结合而被T细胞受体识别,进而激发机体产生特异性免疫反应4-6. 根据其化学结构

4、和功能差异及编码蛋白种类的不同,MHC分为3大类: MHC I、MHC II、MHC III.目前在保护遗传学中的研究主要对象为MHC I类和MHC II类分子5. MHC I类和MHC II类分子具有相似的结构,都是非共价结合的异源双链分子,包含链和链,具有4个胞外结构域,但结构域的组成有所不同7, 8. MHC I类分子所编码的基因 收稿日期:2015-04-16 基金项目:国家自然科学基金(41476113,31272333);福建省自然科学基金(2010Y2007 ). *通信作者:lqx(林清贤);xlchen(陈小麟) 1 在真核细胞中表达,主要功能是递呈内源性抗原(主要是病毒)到

5、CD8+细胞毒性T细胞以激发免疫反应7. MHC II类分子所编码基因主要负责将经过加工的外源性抗原(主要是细菌)呈递给辅助性T细胞的抗原受体(TCR),激活和分化辅助性T细胞,从而诱发免疫应答,是脊椎动物应对细胞外环境病源的主要方式9, 10. MHC具有丰富的多态性,其多态性最丰富的是MHC II 类基因,主要为链基因(B基因),包括1(DAB I)和2(DAB II)均具有高度多态性,特别是其负责编码抗原结合区域的第2外显子(exon2)是目前公认的研究抗病标记和遗传育种的重要基因11, 12. 由于不同外源病原会诱发MHC 产生相应的变化,因此MHC变异能够反映种群内、种群间受到自然选

6、择压力时所产生的适应性,适合用于研究进化生态学和保护遗传学方面的科学问题13-15. 有关鸟类MHC的研究,自Kaufman等报道了鸡(Gallus gallus)的MHC全基因序列以来,目前已对多种鸟类的MHC基因进行了深入的研究,包括朱鹳(Nipponia Nippon)、白腰叉尾雨燕(Oceanodroma leucorhoa)、日本鹌鹑(Coturnix japonica)、蓝冠山雀(Cyanistes caeruleus)、黑琴鸡(Tetrao tetrix)、小斑几维鸟(Apteryx owenii)、小绿鹎(Andropadus virens)等16-23.鸟类MHC的早期研究主

7、要侧重于分析MHC分子结构和应用于物种进化等方面,近年来则倾向于MHC基因的多态性与群体遗传学的研究. 白鹭(Egretta garzetta)是鹭科白鹭属的鸟类,为全球性分布的水鸟24. 近年来关于白鹭的研究,主要集中在其野外生活习性和系统分类地位,而有关白鹭群体遗传学的研究则少见报导25-27. 作为广布种,野外白鹭种群在不同生境下面对各不相同的环境条件,因此受到侵扰的病源也会有所差异,由此可能产生不同的免疫应答反应,进而引起MHC基因水平的差异. 因此,本研究将通过分析白鹭不同地理种群的MHC 遗传多样性水平差异,探讨自然选择压力对白鹭MHC种群遗传结构的影响,以便更好地理解白鹭MHC遗

8、传多样性的进化机制,完善鸟类适应性进化理论. 1 材料与方法 1.1 材料 共取得白鹭个体血液和羽毛组织样品138 份,分别采自福建宁德日屿(RY: 28)、福建厦门鸡屿(JY: 30)、河南信阳(XY: 30)、浙江舟山(ZS: 30)和贵州遵义南白(NB: 30)5个地理种群,所有样品均通过无损伤性取样方法从野外自然繁殖种群个体中获取. 1.2 基因组DNA提取和PCR扩增 采用EasyPure Genomic DNA kit (北京全式金生物公司)提取基因组DNA, PCR采用L i(2011)所设计的引物,引物序列如下:ARB2EN1 (5-ACYKKCCYCCCTGCACAAACAG

9、GG-3), A RB2EC (5-CCCCAGGGARATGTTCTGCCACGC-3),以扩增MHC II DAB I 第2外显子序列28. PC R反应在C1000TM Thermal Cycle (Bio-RAD) PCR 仪完成,反应总体系为25 L,其中包括10 X PCR Buffer、DNA模板3050 ng、0.2 mmol/L dNTP、引物各20 umol/L、1U Taq DNA 聚合酶(TaKaRa),设不含模板的空白对照. PCR 扩增反应循环条件为: 94 预变性5 mi n;94 变性 1 min,58 退火30 s,72 延伸40 s,共30个循环;最后72

10、延伸1 0 min. 1.3 SSCP电泳 通过单链DNA多态性分析方法(Single strand conformation polymorphism,SSCP)筛选不同的等位基因用于分析29. 操作过程如下:将已纯化的PCR产物10 L混合等体积的变性缓冲液(体积分数95%的去离子甲酰胺、10 mmol/L NaOH、20 mmol/L EDTA 和 0.2 g/L 溴酚蓝及0.2 g/L 二甲苯菁),99 加热10 min后迅速冰浴,以维持DNA单链状态.将变性后的DNA置于体积分数8% 的聚丙酰胺凝胶中,在4 、260 V条件下电泳19 h后银染干燥.回收纯化所有认为存在区别的条带并作

11、为二次PCR扩增的模板,以1.2的PCR反应体系和条件进行扩增. 1.4 克隆及测序 将PCR产物在 2.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离,用胶回收试剂盒(Omega cat#: D2500-02)纯化目的片段.将纯化后的PCR 产物连接到pMD18-T载体(TaKaRa),再将重组质粒转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5菌株(TaKaRa),在含有氨苄青霉素LB平板上进行涂板, 37 培养箱中培养16 h. 通过蓝白斑筛选和菌落PCR法筛选阳性克隆. 从每个样品挑选58个阳性克隆,所有克隆均采用载体通用测序引物M13,在上海美吉生物完成测序. 1.5 数据分析 使用软件Las

12、ergene SeqMan Pro 7.1.0拼接校对测序结果,根据判别外显子-内含子的GU-AG 法则,并参照黄嘴白鹭MHC 序列(GenBank: KC282867.1),再用推导的氨基酸序列在GenBank上作BLAST检索来确定是否为MHC 序列. 使用MEGA 6.0软件对外显子氨基酸序列进行序列比对,分别计算外显子核苷酸和氨基酸的变异位点数,等位基因间的p遗传距离和平均遗传距离,用于评估外显子的变异程度30. 从GenBank 数据库上下载3种鹭科鸟类MHC II B基因exon2序列,包括黄嘴白鹭 (Egretta eulophotes,HM991028.1)、岩鹭 (Egret

13、ta sacra,HM991087.1)、夜鹭 (Nycticorax nycticorax,HM991040.1). 基于这些序列利用MrBayes 3.2.3软件,构建贝叶斯树(Bayesian inference),Iset设置替代模型为nst=6(GTR model),位点速度变异模型为rates=gamma(Gamma distribution). 设Nchains=4,建立马尔科夫链,mcmc ngen=2107,每1000代抽样一次,将抽样的25%划为老化样本并舍去,计算相关参数,以后验概率(posterior probability value)评估系统树各分支的置信度31.

14、根据等位基因在各个群体的分布频率,用Arlequin 3.1软件计算群体间分子方差(analysis of molecular variance, AMOVA) 以检验群体间的遗传结构32. 利用PAML4.0软件包中的CODEML程序检测氨基酸水平上受到的选择压力33. 该软件根据选择参数(= d N/d S)的大小,推测目标序列是否经受选择压力,如果显著大于1,则表明存在正选择作用33. 本文主要比较数据组在模型M1与M2, M7与M8之间的差异. 同时根据贝叶斯经验贝叶斯路径 (Bayes Empirical Bayes,BEB) 检测受到正选择作用的氨基酸位点34, 35. 2 结果

15、2.1 MHC II DAB I exon2 的基因序列测定 本研究共计对白鹭138个个体样本的630个阳性克隆进行了测序与分析,所得序列经NCBI中BLAST 同源比对,检索后确定为MHC DAB I exon2基因片断. 每条序列只有在2个或2个以上克隆序列完全一致时才被认定是可靠的序列,用于后续的分析36. 所得MHC DAB I exon2核苷酸序列长度为270 bp,共定义139个等位基因,命名为Egrgat-DAB001 Egrgat-DAB139(图1). 2.2 MHC II DAB I exon2的多态性 139个等位基因经比对排列后,没有发现插入(缺失)或终止密码子. 核苷

16、酸序列变异位点的比例为37.4%(101/270),对应的氨基酸序列变异位点的比例为34.4%(31/90).等位基因间核苷酸位点的变异范围为1228个碱基,氨基酸位点的变异范围为314个位点. Fig.1 Variable nucleotide sites among 139 MHC II DAB I exon2 alleles in little egret 2.3 MHC II DAB I exon 2的选择压力检测 MHC II 分子直接与抗原多肽结合的氨基酸残基称为肽结合位点 (peptide binding residues , PBR). 肽结合位点由于与抗原多样性的相互作用,序列变异较大,当非同义替换率(d N ) /同义替换率(d S )