现代分离分析技术在农药残留分析中的应用.docx
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现代分离分析技术在农药残留分析中的应用
现代分离分析技术在农药残留分析中的应用
张传好
摘要：
本文介绍了四种农药残留分析技术，并重点介绍了今世先进的分离分析技术—酶免疫分析技术的原理、类型、方式的开发和在农药残留分析中的应用。
关键词：
酶免疫分析；农药残留
农药的利用无疑大大提高了农作物的产量，但由此而产生的环境污染问题，已引发人们的高度重视。
世界上许多国家都规定了食物、粮食中各类农药残留的限定量。
连年来，气相色谱、高效液相色谱、质谱等方式已经超级成功地应用于环境分析，能精准地检测残留的农药量。
但是，它们需要昂贵的仪器设备、复杂的前处置、熟练的技术人员及较长的分析周期。
因此，人们迫切希望一种简单、快速、灵敏、价廉的检测技术，能在野外或实验室内进行大量量的检测和挑选实验。
酶免疫分析（EIA）技术就此脱颖而出，尤其在农药残留分析领域，应用十分普遍[1]。
1农药分析技术简介
常常利用的农药分析方式包括：
分光光度测定法，色谱法，毛细管电泳法，电分析方式，发光分析方式，非水滴定法，免疫分析法[2]。
分光光度法
在较早时期，分光光度法分析进程中没有分离步骤，因此颜色反映的特异性就成了目标化合物定量分析的主要因素。
如环境中总涕灭微残留量可用氮基甲酰肟基团的特殊反映来测定。
这种方式由于其操作烦琐，灵敏度低，易受其他物质干扰，故现很少利用。
分光光度法的长处是设备简单，适用于基层生产单位及一般实验室。
色谱法
色谱法是一种分离方式，其利用物质在两相中的分派系数的微小不同进行分离。
当互不相溶的两相做相对运动时，被测物质在两相之间进行持续多次分派，这样原来微小的分派不同被不断放大，从而使各组分取得分离，最终达到分离、分析或测定物质一些物理化学常数的目的。
色谱法主要有：
薄层色谱法（TLC），气相色谱法（GC），高效液相色谱法（HPLC）。
TLC法是一种较成熟、应用也较广的微量快速检测方式，可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的分离和挑选。
先用适宜的溶剂提取农药，经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上展开分离，显色后与标准样比较Rf值进行定性测定。
TLC除用特殊的显色剂观察斑点颜色和用Rf值定性外，与其他技术的连用不仅可以定性，而且可对样品中被分离的一种成份进行定量分析。
气相色谱的流动相为气体，一般适合于低沸点、热稳定性较好的化合物的分离检测。
它的特点是高效、快速和灵敏，其分离分析复杂化合物的能力是以前其它色谱无法比拟的，应用相当普遍。
高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，检测灵敏度高和应用普遍的特点，特别适合于高沸点、大分子强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。
对于受热易分解或失去活性的物质，可用HPLC分析。
另外，色谱-质谱联用技术是今世最重要的分离和鉴定的分析方式之一，既发挥了色谱的高分离能力，又发挥了质谱的高辨别能力。
这种技术适用于多组分混合物中未知组分的定性分析。
目前应用较多的是气相色谱-质谱（GC—MS）联用，但GC要求样品具有必然的蒸气压，只有20％的样品可不通过预先的化学处置知足用气相色谱分离，多种情况下所研究的药物需要通过适当的预处置和衍生化。
毛细管电泳法（CE）
毛细管电泳按照其原理可分为：
毛细管区带电泳（简称CZE）、毛细管凝胶电泳（简称CGE）、毛细管胶束电动电泳（简称MECC）、毛细管等电聚焦电泳（简称IEF）、毛细管等速聚焦电泳（简称TIP）。
由于毛细管电泳具有分离效率高、快速、样品用量少等特点，最近几年来取得了迅速的发展。
在农药残留分析中应用较多的主要有CZE和MECC。
农药按防治对象不同可分为除草剂、杀虫剂、杀菌剂，从结构上讲又可分为手性和非手性农药。
由于它是由结构不同很大的有机化合物组成，其中很多仍是几何、光学异构体或对映体，在水中的极性、溶解度、离子化程度各不同，因此其分离模式就有必然不同。
CZE分离的农药主如果在水溶液中呈离子态的或可离子化存在的化合物，其分离原理主如果它们在形状或质荷比上的不同，故毛细管区电泳超级适用于那些常规液相色谱难以分离的离子型化合物，其分离效率可达数百万理论塔板数，操作简便，具有很大灵活性。
这些方式需要昂贵的仪器设备、复杂的前处置、熟练的技术人员和较长的分析周期。
因这人们迫切希望有一种快速、简单、灵敏、廉价的检测技术。
能在野外或实验室内进行大量量的检测和挑选实验。
酶免疫分析（EIA）技术就此脱颖而出，尤其在农药残留分析领域，应用十分普遍。
2酶免疫分析方式
免疫学检测技术是近几年发展起来的新技术。
这种方式是将免疫反映和现代测试手腕相结合而成立的超微量测定技术。
免疫是机体识别和排除进人体内的抗原性异物的保护性应答反映。
免疫分析法就是基于抗原抗体的特异性识别和结合反映为基础的分析方式。
分子量大的农药（如苏云金杆菌毒素等）可以直接作为抗原免疫动物，动物的免疫系统对进入体内的异源大分子量物质发生保护性应答反映。
分子量小的农药（MW<2500）一般不具有免疫原性，不能刺激机体产生免疫反映，但有与相应抗体在体外发生吸附反映的能力，即有反映原性，这种小分子物质在免疫学上称为半抗原。
将农药小分子以半抗原的形式连接到分子量大的载体蛋白上，形成农药-载体蛋白结合物免疫原，即人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反映，产生对该农药具有特异性的活性物质——免疫球蛋白（即抗体），来识别该农药分子并与之结合，这种反映不仅可在体内进行，也可在体外进行。
这种方式具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、价廉、样品所需量少等长处，已迅速发展成为生物化学、医学、药物化学等研究领域的重要工具[1,3,4]。
免疫分析方式被称为是利用抗体作为“生物化学检测器”的分析技术[5]。
为了揭露微量抗原与抗体的免疫学反映，需要引入一个示踪物，通常利用的有放射性同位素、酶和荧光素，按照示踪物的不同，别离称为放射免疫分析（RIA）技术、酶免疫分析（EIA）技术和荧光免疫分析（FIA）技术。
由于EIA技术较为安全、稳定、灵敏，故其应用最为普遍[6]。
农药酶免疫分析方式类型及原理
酶免疫分析法是用酶标记抗原、半抗原或抗体而成立的方式。
按照其特点和步骤可分为酶联免疫吸附测定法（ELISA）和酶放大免疫测试法（EMIT）。
ELISA是一种主要的免疫分析方式，又可分为直接竞争法、问接竞争法、双抗体夹心法和间接夹心法。
直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反映板上，加人酶标记农药和待测农药，酶标记农药和待测农药之间与抗体的竞争而发生结合反映。
由于待测农药多，则反映后被吸附到反映板上的酶标记农药少，即吸附到酶反映板上的酶标记农药的量与待测液中农药的含量成反比。
加人酶底物显色后，进行比色，可以测定待测农药含量。
间接竞争法的前一部份与抗原包被直接竞争法相同，只是不用酶标记农药抗体（一抗），而是标记第二抗体，在竞争反映结束后，加入酶标二抗，发生一抗与酶标二抗的结合反映，被结合的酶标二抗的量与包被抗原结合的一抗的量的转变趋势是一致的，即被结合的酶标二抗的量与待测农药的含量成反比。
此方式的长处是一个农药抗体可以结合多个酶标二抗，大大提高了方式的灵敏度。
双抗体夹心法[7,8]是将抗体包被固相载体，加入待测抗原使其与过量的固相抗体结合，再加入过量的酶标记相同的抗体，分离固相和游离相的化合物，加入底物，据显色程度来求出样品中抗原的含量。
间接夹心法是将样品中的抗原结合于过量的固相抗体，加入过量的同种抗体（一抗），洗涤后加入酶标二抗，最后加入底物反映，据显色程度肯定待测抗原的含量。
EMIT是一种经典的均质酶免疫测试技术。
大体原理是用特定的酶标记待测农药，然后将抗体、酶标记农药、待测农药同时加人反映试管中进行竞争反映。
酶标记的待测农药与抗体结合后，酶被抑制而失去活性。
样本中待测农药越多，则游离的未被抑制的酶也越多，按照吸附反映后酶活性的改变可以测定出农药的含量。
该法的缺点就是每一种待测农药都必需进行酶标记，限制了该法的推行应用。
抗体、抗原的合成
（1）免疫原的合成和酶标抗原的制备
半抗原的农药小分子只有偶联到载体蛋白上，才能诱导机体产生免疫应答反映。
因此，在制备抗体前首先要合成农药-载体蛋白结合物免疫原。
载体蛋白不单单是增加半抗原的相对分子质量，也不是单纯的起运载作用，而是依托本身的结构特异性——免疫原性，才能诱导体液抗体的产生和继而诱导对半抗原农药分子的识别，这种现象称为载体效应[9]（carriereffect）。
常常利用的载体蛋白有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血清蓝蛋白等。
如何将半抗原的农药小分子偶联到大分子的载体蛋白上，人们进行了许多研究工作，成立了多种偶联方式。
一般都是利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、酚基、巯基或羟基进行化学反映。
常常采用的偶联反映有重氮化法、碳二亚胺法、混合酸酐法、戊二醛法等。
农药衍生和连接的化学反映条件不该致使半抗原分子结构发生明显改变，不然抗原性将发生转变[10]。
另外，制备好的半抗原结合物在免疫动物前，要测定结合物中半抗原数量，因为结合物中半抗原分子数量太多或太少，诱发抗体的能力都很差。
用于合成农药-载体蛋白结合物的方式，在不引发酶失活的情况下，通常都可用来连接酶与农药，制备酶标农药抗原。
（2）抗体的类型及合成
抗农药抗体分单克隆抗体和多克隆抗体。
多克隆抗体可用农药一载体蛋白结合物直接免疫兔子等动物，从被免疫的动物血清中来取得。
这种抗体用于免疫分析效果良好，但缺点是抗体不均一，来源是中断的，有较大的批间不同。
自20世纪7O年代发展单克隆抗体技术，至今已日趋成熟。
单克隆抗体是指在一株B淋巴细胞系中的每一个细胞只能产生一种专有的、针对一种它能识别的抗原决定簇的抗体。
由这样一株B细胞系产生的抗体即为单克隆抗体。
由于它是针对抗原某一决定簇的，因此是一种均质的高特异性抗体，而且可以在体外培育液中继续培育，或接种在小鼠腹腔内传代。
单克隆抗体虽然生产本钱高。
技术复杂，但其特性稳定，交叉反映少，可大量量生产。
3.酶免疫分析技术在农药残留分析中的应用
EIA技术可以用于检测水、土壤、食物中的各类农药残留，方式简便、快速、前处置程序简化（不需净化），反映既可在试管中进行，也可在微孔板上进行；若在96孔板上，每次可分析几十个样品，且可同时作出标准曲线。
目前应用最多的是酶联免疫吸附（ELISA）测定法。
Selisker[11]等采用竞争ELISA法用兔抗百草枯抗体包被磁株固相检测百枯，从各类水果和蔬菜中提取百草枯只用30min，检出限为10ng·g-1。
，平均回收率达99%，而用分光光度计法样品提取则需5h，两种检测方式相关系数达。
Schlaeppi[12]等运用直接竞争EIISA法和间接竞争ELISA法别离检测土壤中的异丙甲草胺，产生的抗异丙甲草胺单克隆抗体有极强特异性，与其代谢产物无交叉反映，直接和间接竞争ELISA法对土壤中异丙甲草胺的回收率别离为98%和89%。
Brandon[13]等在1994年制备了一种可以与苯并咪唑类药剂（丙硫多菌灵、芬苯达唑、奥芬达唑及它们的代谢物）结合的单克隆抗体，该抗体也可与甲基苯并咪唑氨基甲酸酯（苯菌灵的一种代谢物）结合。
新的半抗原5（6）一（羟基戊基一硫代）一2一苯并咪唑氨基甲酸酯可在大鼠体内取得，这种改良了的ELISA法可以检测苯并咪唑及多种农药，检出限为1-8μg·kg-1。
我国的研究者也自行开发了许多EIA检测方式[14]：
①成功地合成了对硫磷人工抗原，并在免疫的兔子体内取得高效抗血清。
在此基础上，应用了ELISA法对梨、苹果中的对硫磷残留量进行检测，并以GC法验证，充分说明其具有良好的重现性。
②通过化学方式，将杀虫脒偶联到载体蛋白上制成抗原，然后免疫BALB／C小鼠。
经细胞融合、挑选、克隆等步骤，取得了抗杀虫脒的特异性抗体，并以该抗体成立了大米中杀虫脒残留量的单克隆抗体ELISA检测方式。
③应用B淋巴细胞杂交瘤技术，研制出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体，并成立了小麦T-2毒素的ELISA检测方式。
表1-3列出了国内外有关水、土壤、食物中部份除草剂、杀菌剂、杀虫剂类农药残留的酶免疫技术检测的方式类型、检出限、抗体类型、检测范围和农药种类等有关情况。
表1除草剂酶免疫技术检测
Enzymeimmunoassaysappliedtoweedkiller
除草剂种类
检测方法
抗体类型
检测样品种类
检出限
文献
阿特拉津
ELISA-kit
ELISA
ELISA
Poly
Poly
牛肉、牛肝、猪油
水
土壤
1μg·Kg-1
西玛津
ELISA
Poly
·mL-1
16
扑草净
ELISA
Poly
2ng·mL-1
16
莠去津
ELISA
Poly
1ng·mL-1
16
甲草胺
ELISA-kit
牛肉、猪油
1μg·Kg-1
13
百草枯
ELISA
Poly
水果、蔬菜
10μg·Kg-1
9
2，4-D
ELISA-kittube
牛肉、牛肝、猪油
μg·Kg-1
13
绿麦隆
ELISA
水
·L-1
17
表2杀菌剂酶免疫技术检测
Enzymeimmunoassaysappliedtobactericides
杀菌剂种类
检测方法
抗体类型
检测样品种类
检出限
文献
多菌灵
ELISA-kittube
牛肉、猪油
5μg·Kg-1
13
涕必灵
ELISA
Mono
马铃薯、苹果
200μg·Kg-1
18
百菌清
ELISA
Poly
西红柿、苹果
·g-1
19
苯并咪唑类
ELISA
Mono
肝
1-8μg·Kg-1
11
三唑酮
ELISA
黄瓜、梨
40ng·g-1
20
表3杀虫剂酶免疫技术检测
Enzymeimmunoassaysappliedtoinsecticides
杀虫剂种类
检测方法
抗体类型
检测样品种类
检出限
文献
杀螟松
ELISA
谷物
100μg·Kg-1
2
乙基虫螨磷
ELISA
谷物
30μg·Kg-1
2
克百威
ELISA-kittube
Poly
奶、肉、肝
100μg·Kg-1
21
ELISA-kittube
肉
1μg·Kg-1
13
涕灭威
ELISA-kittube
Poly
奶、肉、肝
4-380μg·Kg-1
21
氯菊酯
ELISA
谷物
μg·L-1
17
EIA技术还可以与其它技术如色谱、流动注射技术、超临界流体提取技术等联用，从而使之具有更好的选择性、灵敏性和快速测定等特点。
Kricka等将EIA技术与流动注射分析技术相结合，检测水中的三嗪，检测灵敏度为0．O2～O．3μg·L-1，分析所需时间由ELISA的1．5h缩至6．5min。
Dosch．M等于1995年利用SFE-EIA联用技术将土壤中与腐殖酸结合的农药残留提取并测定，检出限在1O-9～10-12g之间。
EIA技术与气相色谱／质谱（GC／MC）的联用可以减少结构相似农药或代谢产物测试中的交叉反映，以降低假阳性。
有研究者以为[15]，把几种结构相关或非相关的农药抗体结合，利用这种混合技术进行几种农药的多残留分析，对于检测大量量且农药污染又没有规律的样品，可以节省大量的时间和工作量。
农药残留的免疫分析方式是临床免疫法在分析化学领域的延伸[16]。
十连年来，EIA技术在农药残留分析领域中已取得了极大的进展。
有文献报导国内外已经开发出杀虫剂、杀菌剂、除草剂等4O余种农药的酶免疫分析方式。
其顶用于田间快速挑选的酶免疫分析试剂盒已商品化。
这种方式具有快速、简单、灵敏、选择性高等长处，不仅可用来定性挑选，而且可以用来定量分析，灵敏度可达ng级乃至pg级水平。
随着对EIA技术的不断开发和完善，并与其它技术有机结合，其在农药残留分析领域应用前景十分广漠。
参考文献
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