组织固定原理.docx

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组织固定原理

动物组织的固定原理及固定液

在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是大体标本的保存，都必须进行及时的适当的和有效的固定。

组织只有经过固定，才能完成随后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

（一）、固定的作用

组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。

固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。

（二）固定的目的

1、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。

细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。

固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。

另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？

除了细菌参与外，其本身也是很重要的。

因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。

2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。

细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。

这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。

3、使组织硬化，便于切块。

刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。

4、对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。

病理标本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。

对于此类标本，应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在3-5天。

5、保存好大体标本。

对于有教学任务的医院病理科，除搞好疾病的诊断外，还有收集有价值的大体标本，有些大体标本，是很难得到的。

因此要求在平时就要留心观察，小心处理。

遇到有教学价值的罕见的典型的标本，就必须及时固定，认真给予对待。

6、可增强染色的作用。

组织经过及时的固定，最终可见到切片有鲜艳的染色，而些时如果有一批未经及时固定的组织，将看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论，固定可以增强染色的作用。

（三）固定的注意事项

1、组织固定越新鲜越好。

组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。

根据实验，如果要获得某些酶的染色，固定最好在组织离体后30秒至1分钟。

对于其它达不到些要求是越快越好。

2、组织固定，组织块不宜过大。

凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。

如果较大厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶了。

因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材料再行固定，这是最佳的处理方法，如遇到胃肠的器官，则应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时，难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。

3、对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。

有的固定液对于组织有膨胀作用。

固定剂是一种化学试剂，有液体和固体之分，一般使用较多的是液体，而固体固定剂如多聚甲醛，则多用于实验研究的组织固定。

固定剂的种类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同，对于每个既定的组织化学方法来说，选择最合适的方法是极为重要，在组织化学研究准备阶段不论采用什么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分的反应基团的效用。

理想的固定剂必须具备的条件是，防止渗透损伤和妆缩，以达到在各级可见度的水平皆无形态变化；要求组织所有的成分能保留于原位。

他认为有三种试剂即甲醛、戊二醛和丙稀醛接近于达到上述要求。

为了更好地把组织中各种成分尽量保存好，尽量好给予显示出来，就决不能千篇一律地使用一种固定液，而必须认真地深入研究各种固定液的性能和使用方法。

例如：

丙酮，它对组织有明显的皱缩，硬化作用，平常它是决不会被用来作固定液的，用它不但太浪费，造价太高，而且也使切片较为困难，但是，对于某些酶的研究，狂犬病脑组织的固定，某些细胞的培养等。

最好的固定液还是丙酮。

因为如果使用福尔马林固定液、石蜡切片显示酸碱磷酸酶就显示不好，狂犬病病毒的包函体就会消失掉，又如醋酸，它对胶原纤维等有膨胀的作用。

由于各种固定液对不同的组织有不同的作用，因此许多专家将根据各种固定液的优缺点，配制出许多混合液的方法来，给组织的良好固定起到了非常积极的作用。

但是，值得指出的是并非所有的固定液都不是十全十美的，例如，酒精、甲醛、醋酸固定液，对组织固定很好，组织中各物质的染色也十分清晰，但对固定脱水盒为铜质的组织时，效果就不好，原因是醋酸跟铜可发生反应，产生醋酸铜，沉淀于组织中，可造成对抗原的损害，对于免疫组织化学的显示，经实验证明：

可呈弱阳性乃至阴性。

由此可见，固定液的选择正确与否决定着对某些病例的免疫组化标记的成败关键。

在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意的效果。

4、组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。

时间太短，就不能很好的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以保证，固定时间太长，也不好。

组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。

对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。

另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。

固定时间过长，可降低抗原的活性。

5、固定液的量要充分。

固定液量的足够与否决定着组织固定的成败，有的人认为，固定液的量与组织的比应是20：

1，这个要求对于小组织来说是完全可以达到的，但对于大标本来说，则是一件非常困难的事情。

因为对于大医院来说，每天都有几十上百例的标本，小如大头针大小，大的达几十斤的肿瘤，对于这样大的标本，按20：

1的比例来做，显然是不可能的事，既要做到组织能固定好，又不使组织吹干就必须具体情况具体处理。

对于大的标本，原则上是不让其暴露部分被吹干，这是因为在现实当中，大的标本往往露出容器一大半，因此对于这种情况，应取些脱脂棉或纱布，浸湿固定液后，盖于组织表面，以免使组织被风干，影响制片效果。

6、特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。

一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。

但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。

固定剂是一种化学语试剂，有液体和固体及之分，平常使用的多为液体，对每个既定的组织化学方法来说，选用最合适的固定方法是极为重要的；在组织化学研究中的准备阶段，不论采用什么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分反应基团的效用。

7、组织的第二次固定或后固定。

在一般的常规病理活检组织中，往往用一种固定液，就能够达到目的，获得满意的结果。

但是，对于某些特殊病例光用一种固定液是不够的，必须根据不同的情况，使用特殊的固定液再次将组织固定，或者在切片后染色前再行固定。

这种方法称为二次固定或后固定。

（四）固定液的使用

当前，应用于固定试剂的种类较多，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的固定组织。

根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：

Ⅰ类：

醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。

Ⅱ类：

氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。

Ⅲ类：

蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。

Ⅳ类：

其他，氯化汞，苦味酸等。

上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。

下面根据使用的需要，将着重介绍几种常用的固定剂。

甲醛：

可配成简单的或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，这就是10%的福尔马林.当然,现在使用的固定液要求较为严格些,最好是使用缓冲福尔马林固定液,这将有利于后来的免疫组化染色的需要.

从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:

1.组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.

2.固定均匀,穿透力强.

3.能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.

4.能保存脂肪及脂类物质.

5.成本较低.

虽然甲醛有上述的优点,但这都是相对而言,任何物质都不可能十全十美的,它也有许多缺点:

1.杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.

2.含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.

3.可产生福尔马林色素,影响观察.

4.不能固定尿酸和糖类物质.

5.容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.

6.可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,但需要经过长时间的流水冲洗（24天的冲洗）方能除去.可见存在于组织上的甲醛是不可能除去的.因为临床活检不可能有这么长的时间来冲洗组织.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败.

酒精：

又称乙醇，为无色透明的液体，沸点是78度，工业酒精是95%。

酒精它有许多优点：

1.可保存尿酸结晶和糖原等物质。

高浓度的酒精如95%，无水酒精可保存上述两种物质，因它们易溶于水，因此，要证明上述两种物质的存在，就不能用含水的固定液来固定组织。

2.能在任何比例的情况下与水混合，在病理技术中，酒精是一种十分重要的试剂，它起着关键的作用。

如果没有酒精，将会无法完成必要的工作。

如组织的脱水，切片染色前后都离不开酒精，在常规的工作中，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。

3.可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。

常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，常用的有苯类试剂，苯不溶于水，但能溶于酒精，酒精在这里充担着除去苯和连接水的作用，为切片入水架起了桥梁，因此称它为桥梁试剂。

4.能除去切片上的水份，使切片无水化。

切片经染色后，由于所用的试剂都为水溶液，因此在切片上含有大量的水份，这些水份经系列梯度酒精的置换吸附后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。

5.可用来保存标本。

大体标本经福尔马林固定后，如为了陈列保存，必须取出冲冼。

然后移入75%的酒精中。

如果用福尔马林作陈列标本的固定液，则因为福尔马林含有杂质较多，液体容易酸化，时间一长，会逐渐变为微黄色或淡黄色，影响美观，影响陈列的效果。

6.可与其它试剂配成多种的混合固定液，有时为了加快固定，常采用酒精和其它试剂来配成混合固定液，这种固定液在固定的同时，兼有对组织脱水的作用。

应用酒精配成的混合固定液有：

①Carnoy氏固定液

氯仿300ml

冰醋酸100ml

95%酒精600ml

该固定液固定组织快速，在固定的同时兼有脱水的作用。

溶液中的氯仿和酒精，对组织的收缩较厉害，但应用了冰醋酸，这种现象便被中和去。

2AF固定液

甲醛100ml

冰醋酸50ml

95%酒精