五种常用的植物转基因技术.docx

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五种常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术

杂粮作物2010

.

30（3）:

186～189RainFedCrops''……

文章编号:

1003—4803（2010）03—0186—04

五种常用的植物转基因技术

汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞

（1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167）

摘要:

从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管

通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍.

关键词:

农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点

中图分类号:

$336文献标识码:

B

植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的

方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植

物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物

预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转

基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技

术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育

种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自

于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生

物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以

改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组

技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的

来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植

物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许

多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等

其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型,

植物转基因方法可以分为3大类:

以外植体为受体的基因

转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以

原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法,

脂质体法及磷酸钙?

DNA共沉淀法;以种质系统为受体的

基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以

原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大,

培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生

质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期

长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以

该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛

使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导

法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺

点作以简要介绍.

1以外植体为受体的基因转化方法

1.1农杆菌介导法

农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多

成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍

存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基

因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌

农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构

和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含

有3个功能区:

参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农

杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农

杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群

作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植

物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-

DNA是质粒上一段10～30kb的序列,它的两端各有一段

高度保守的25bp的同向重叠序列.由于T.DNA转化

无序列特异性,因此可用任何基因片段代替原来的T.DNA

基因片段进行.

农杆菌介导法的原理是:

在农杆菌基因chvA,chvB,

pscA,andatt家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类

物质和糖类物质的共同作用下,农杆菌识别并附着在宿主

细胞壁上.virD4和virB基因编码蛋白组成的typeIV分

泌系统将单链VirD2一T—DNA复合体运送到宿主细胞

内.此外,VirE3,VirE2和VirF蛋白也通过该系统进

入宿主细胞质中.在宿主细胞质中,VirE2蛋白与

VirD2一T—DNA复合体结合.在VirD2核定位信号,某些农

杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下,VirD2.T—DNA复

合体进入细胞核.在VirD2,VirE2,某些宿主细胞核蛋白

如AtKu80和DNA连接酶的作用下,T—DNA被整合到宿主

基因组中,但具体过程不详"].

农杆菌介导法的基本步骤是:

（1）诱导目标植物外植

体;

（2）构建含有目的基因的质粒;（3）质粒导入合适的农

杆菌菌株中及该菌株的活化过程;（4）植物愈伤组织的微

伤口处理及农杆菌侵染;（5）共培养及脱菌处理;（6）愈伤

组织筛选,分化与植株再生;（7）再生植株及其后代的外

源基因及其表达产物的分子检测;（7）转基因Tl代的目

标性状鉴定".

农杆菌介导法具有操作简单,转化效率较高,重复性

好,单拷贝整合,基因沉默现象少,转育周期短,转化片段

收稿日期:

2010—03—26

作者简介:

汪由（1977一）,男,硕士,助理研究员,主要从事玉米分子育种研究.

第3期汗由等:

五种常用的植物转基因技术l87

较大且插入片段明显及实验费用低等优点,因此,农杆菌

介导法是目前应用最广泛的一种植物转基因方法.但

是,农杆菌介导法也存在一些问题.首先,在自然条件下,

农杆菌只侵染双子叶植物.对于单子叶植物,虽然可以采

用人工添加酚类物质的方法,诱导农杆菌完成侵染过程,

但是单子叶植物的组织培养有一定的难度.目前,只发现

20多种单子叶植物能被农杆菌侵染.其次,植物细胞壁

对农杆菌介导转化效果有一定影响.再次,影响农杆菌转

化效率的因素较多.在设计农杆菌介导实验时,研究者要

考虑农杆菌菌株类型,质粒载体类型及两者间的匹配情

况;外植体的基因型,来源和发育状态;培养基成分及某些

诱导条件如是否加入酚类物质等.此外,植物愈伤组织的

诱导过程有时会存在困难'"..

1.2基因枪法

基因枪是20世纪8O年代初由同艺学家Sanford等人

发明的.在此基础上,Klein等以基因枪为工具发展了一

套物理学转基因方法.经过l0多年的改进和提高,基

因枪的发展经历了3个阶段:

第一代基因枪是1987年由

Sanford等设计制造的火药基因枪,它是以火药爆炸的冲

力为动力;第二代基因枪是高压放电基因枪,它是以高压

放电引起水滴汽化所产生的冲力为动力;第三代基因枪是

压缩气体驱动基因枪,它是以高压惰性气体为动力.由于

存在明显的安全性和稳定性问题,前两代基因枪现已基本

被淘汰.¨.作为一种物理学方法,基因枪技术已成功应

用在烟草,水稻,小麦,甘蔗,棉花,大豆,洋葱,番木瓜和葡

萄等许多农作物的品种改良上,并且该技术被用于瞬间表

达研究和培育稳定的转基因植株等研究领域.

基因枪法的原理是:

利用基因枪产生的高压动力冲击

波将包裹外源DNA的重金属颗粒（如钨粉,金粉等）射穿

植物细胞壁和细胞膜,射入植物细胞,使外源DNA随机整

合到植物细胞染色体中,达到使外源DNA在受体植物中

正常表达和稳定遗传的目的'.

基因枪法的基本步骤是:

（1）诱导目标植物外植体;

（2）构建含有目的基因的质粒或制备外源DNA样品;（3）

重金属颗粒的外源基因包被过程;（4）植物愈伤组织的前

处理;（5）基因枪轰击过程;（6）愈伤组织筛选,分化与植

株再生;（7）再生植株及其后代的外源基因及其表达产物

的分子检测.

基因枪法具有操作方法简单,转化时间短,数量大,对

受体植物几乎无要求,基因用量少,可转化基因片段大,可

获得较长时间的瞬时表达,实验费用低等优点.然而

基因枪法也有许多缺点.首先,由于基因枪法转导的外源

DNA是随机整合到宿主基因组中的,这不利于外源DNA

在宿主植物中稳定地表达和遗传.其次,因为随机整合位

点不固定和外源DNA拷贝数多等问题会导致转基因后代

的突变率提高,整合的外源DNA丢失及基因沉默等现象.

此外,基因枪法还存在转化过程对细胞有损害,转化率低,

嵌合体多,可重复性差及设备昂贵等缺点...

1.3超声波介导法

作为一种新创建的物理学基因转化方法,超声波介导

法已被用于真核生物的基因转化研究和人类基因治疗领

域.在农作物基因转化研究中,超声波介导法已成功

地将外源DNA转导人烟草和甜菜的原生质体,玉米和小

麦的未成熟胚及烟草的叶片中.目前,该方法常与农

杆菌介导法共用以提高外源DNA的转化效率'.

超声波介导法的原理是:

利用超声波的空化作用,在

细胞膜上产生可恢复的渗透孔空洞,从而使外源DNA进

入细胞'.

超声波介导法的基本步骤是:

（1）目标植物外植体的

制备;

（2）目的基因的制备;（3）超声波处理;（4）转化受体

俞伤组织的筛选与植株再生;（5）再生植株及其后代的外

源基及其表达产物的分子检测'".

超声波介导法的优点有:

该方法不受宿主范围的限

制,可以将外源基因导入任何基因型的植物细胞内:

该方

法可以避免对细胞的机械性损伤,有利于原生质体的存

活;该方法操作简便,设备便宜等优点.由于超声波介

导法也存在外源DNA随机整合及外源DNA拷贝数多等

问题.因此,该方法也会导致转基因后代的突变率提高,

整合的DNA丢失及基因沉默等现象.

2以种质系统为受体的基因转化方法

2.1子房注射法

子房注射法是一种育种工作中经常使用的简便易行

的植物转基因方法.1993年,丁群星及其同事首次使用

子房注射法将Bt基因导入玉米子粒中并成功获得了具有

一

定玉米螟抗性的转基因玉米".目前,子房注射法成

功用于玉米,小麦,甜瓜和黄瓜等农作物的转基因育种T

作中,.

子房注射法的原理是:

使用微注射针或显微注射仪将

外源DNA注入处于减数分裂期的受体植物的子房中,借

助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力,外源DNA进

入受精的卵细胞中,借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的

复制,重组,缺失或易位等现象,外源DNA被随机整合到

受体染色体上".

子房注射法的基本步骤是:

（1）目的基因的制备;

（2）

根据受体植物受精后其子房的变化特点,确定最佳时间,

进行外源DNA注射或将离体的受精子房进行外源DNA

注射,再对该离体子房进行培养;（3）转化种子及其后代

的外源基因及其表达产物的分子检测.

子房注射法的优点:

该方法无需组织培养过程,凶此

实验过程简单,操作便捷;该方法所用的仪器设备简单

便宜;外源DNA直接注射进入子房可以提高转化率;

该方法可以直接得到转化种子,因此缩短了育种周期".

其缺点是:

田间转化过程的工作量大;转化过程中,子房受

到机械性伤害易导致转化率和结实率低;易产生杂基因污

染;该方法只能在授粉期进行,受季节和天气等自然

1_88杂粮作物第3O卷

条件影响;由于后代群体规模较大,筛选过程丁作量较

大..

2.2花粉管通道法

2O世纪70年代末期,在DNA片段杂交假设理论和对

植物开花受精过程的解剖学及细胞学特征研究的基础上,

周光宇等推测外源DNA可以通过花粉管经过的珠心通道

进入受精胚囊,转化进入精卵融合细胞,早期合子及早期

胚细胞.随后,周光宇等创建花粉管通道技术并通过该技

术将外源DNA导人陆地棉,成功地培育抗枯萎病的新

品种[34,3S,36].目前,花粉管通道法已成功应用于棉花,水

稻,小麦,大豆等农作物的改良和育种工作.

花粉管通道法的原理是:

在植物授粉后的特定时期

内,利用精卵融合细胞,早期合子及早期胚细胞无细胞壁

和核膜结构的特点,以柱头内形成的花粉管为通道,将外

源DNA导人受精胚囊.在受精后细胞基因组合成和复制

活跃的条件下,将外源DNA随机整合到受体植株基因组

上E35].

花粉管通道法的基本步骤是:

（1）目的基因的制备;

（2）根据受体植物受精后,