出口食品的大肠菌群的检测.docx

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出口食品的大肠菌群的检测

中华人民共和国进出口商品检验行业标准

　　　　出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法　　SN0169-92

　　　　　　　　　　　　代替ZBX09002-88

Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliform

andescherichiacoliinfoodforexport

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1　主题内容与适用范围

　　本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。

　　本标准适用于出口食品的检验。

2　设备和材料

2.1　吸管:

1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。

2.2　水浴箱：

44.5±0.5℃。

2.3　培养箱：

36±1℃,44.5±0.5℃。

2.4　冰箱:

0～5℃和-15～-20℃。

2.5　均质器。

2.6　乳钵和研棒。

2.7　平皿：

直径90mm。

2.8　天平：

感量0.1g。

2.9　显微镜。

2.10稀释瓶：

100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。

2.11玻璃珠：

直径约5mm。

2.12菌落计数器。

3　培养基及试剂

3.1　月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤。

3.2　煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。

3.3EC肉汤。

3.4　伊红美蓝琼脂（EMB）。

3.5　营养琼脂斜面。

3.6　色氨酸肉汤。

3.7MR-VP培养基。

3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。

3.9　结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。

3.10　Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。

3.11生理盐水。

3.12革兰氏染色液。

3.13Kovacs氏靛基质试剂。

3.14甲基红指示剂。

3.15Voges-proskauer（V-P）试剂。

4　样品制备

4.1　以无菌操作取有代表性的样品。

如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。

若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。

检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。

4.2　不同食品样品匀液的制备

4.2.1　液体食品

以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）,以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇）,制成1:

10的样品匀液。

4.2.2　固体和半固体食品

　　以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:

10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。

4.3　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。

从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。

5　大肠菌群的测定

5.1　大肠菌群MPN值的测定

5.1.1　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。

每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤,每管接种1mL。

5.1.2　将接种管置于36±1℃培养48±2h。

5.1.3　观察试管的产气情况：

检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。

如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。

5.2　大肠菌群的证实试验

5.2.1　将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。

5.2.2　置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。

5.2.3　记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

5.2.4　结果报告：

按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B（补充件）]报告每克（毫升）样

品中大肠菌群的MPN值。

6　粪大肠菌群测定

6.1　用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。

6.2　将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。

水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。

应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

6.3　记录EC肉汤管的产气情况。

产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。

6.4　结果报告：

按产气管数,查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。

7　大肠杆菌测定

7.1　将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板,36±1℃培养24±2h。

7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

7.3　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。

用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。

7.4　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。

7.4.1　色氨酸肉汤：

在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。

7.4.2MR-VP培养基：

在36±1℃培养48±2h。

以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。

　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。

如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。

7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤：

于36±1℃培养96h记录有无生长。

7.4.4LST肉汤：

于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。

7.4.5　革兰氏染色：

取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。

大肠杆菌为革兰氏阴性。

7.4.6　大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：

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　　靛基质┃　　MR　　┃　　VP　　┃　枸椽酸盐┃鉴定（型别）

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　　　　＋　┃　　＋　　┃　　－　　┃　－　　　┃典型大肠杆菌

　　　　－　┃　　＋　　┃　　－　　┃　－　　　┃非典型大肠杆菌

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　　　　＋　┃　　＋　　┃　　－　　┃　＋　　　┃典型中间型

　　　　－　┃　　＋　　┃　　－　　┃　＋　　　┃非典型中间型

━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━

　　　　－　┃　　－　　┃　　＋　　┃　＋　　　┃典型产气肠杆菌

　　　　＋　┃　　－　　┃　　＋　　┃　＋　　　┃非典型产气肠杆菌

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　　如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。

7.5　结果报告：

大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN值。

8　大肠菌群固体培养基测定法

8.1　样品制备同第4章。

8.2　计数

8.2.1　选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。

另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。

8.2.2　将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）10～15mL倾注于每个平皿中。

小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。

8.2.3　待琼脂凝固后,再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。

8.2.4　翻转平板,置于36±1℃培养18～24h。

8.2.5　选用有30～150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。

菌落直径为0.5mm或更大。

8.2.6　证实

8.2.6.1　从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内,36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。

8.2.6.2　将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。

对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。

8.2.7　结果报告

　　经最后证实为阳性（产气,革兰氏阴性杆菌）的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克（毫升）样品中大肠菌群数。

　　例：

10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接

种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：

　　100×6/10×10**4/g（mL）＝6.0×10**5/g（mL）

附　录A　

　　　　　　　　　　　　　　培养基和试剂

　　　　　　　　　　　　　　　（补充件）

A1　月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤

　　胰蛋白（月示）或胰酪胨（Trypticase）20g

氯化钠　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　乳糖　　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g

　　磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g

　　月桂基硫酸钠0.1g

　　蒸馏水1000.0mL

　　将各成分溶解于蒸馏水中。

分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

最终pH6.8±0.2。

A2　煌绿乳糖胆盐（BGAB）肉汤

　　蛋白胨10.0g

　　乳糖　10.0g

　　牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200.0mL

　　0.1％煌绿水溶液13.3mL

　　蒸馏水1000.0mL

　　将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,pH7.0～7.5）,用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。

再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管）中,每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

最终pH7.2±0.1。

A3EC肉汤

　　胰蛋白（月示）或胰酪（月示）20.0g

　　3号胆盐或混合胆盐　　　1.5g

　　乳糖　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）4.0g

　　磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g

　　氯化钠　　　5.0g

　　蒸馏水1000.0mL

　　将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管）,每管8mL。

121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。

A4　伊红美蓝琼脂（EMB）

　　蛋白胨10.0g

　　乳糖10.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0g

琼脂15.0g

　　伊红γ（水溶性）　　0.4g或2％水溶液20mL

　　美蓝　　　　　　　0.065g或0.5％水溶液13mL

　　蒸馏水　　　　　　1000.0mL

　　在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。

分装于三角烧瓶中。

每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。

最终pH7.1±0.2。

使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳