第二章基因工程的酶学基础.docx
《第二章基因工程的酶学基础.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二章基因工程的酶学基础.docx（53页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
第二章基因工程的酶学基础
幻灯片1
第二章基因工程的酶学基础
Enzymes
幻灯片2
第一节限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶
（Restrictionendonuclease）
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
幻灯片3
1.来源
原核生物。
2.性质
内切酶。
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
3.功能
自我保护作用。
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
幻灯片4
（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。
幻灯片5
（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
①Dam甲基化酶
GATC腺嘌呤N6位置引入甲基
②Dcm甲基化酶
CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基
幻灯片6
幻灯片7
二、限制性内切酶的类型
目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
I型限制性内切酶
II类限制性内切酶
III类限制性内切酶
幻灯片8
1.I型限制性内切酶
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。
如EcoB和EcoK。
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。
EcoB：
TGA（N）8TGCT
EcoK：
AAC（N）6GTGC
幻灯片9
（2）切割位点
在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。
Recognizesite
cut
1-1.5kb
（3）作用机理
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
幻灯片10
2.II类限制性内切酶
首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是HindⅡ
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。
与DNA的来源无关。
幻灯片11
（2）切割位点
识别位点处。
切开双链DNA。
形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。
如：
EcoRI5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
PstI5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
产生粘性末端
EcoRV5’-GATATC-3’
3’-CTATAG-5’
产生平齐末端
幻灯片12
（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）
含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
①5’端凸出（如EcoRI切点）
GAATTC
5’-
-3’
CTTAAG
3’-
-5’
5’-
GAATTC
-3’
CTTAAG
3’-
-5’
幻灯片13
②3’端凸出（如PstI切点）
CTGCAG
5’-
-3’
GACGTC
3’-
-5’
5’-
-3’
CTGCAG
3’-
-5’
GACGTC
幻灯片14
（4）粘性末端的意义
①连接便利
i）不同的DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
幻灯片15
幻灯片16
②5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。
③补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
幻灯片17
（4）同裂酶（Isoschizomers）
识别位点的序列相同的限制性内切酶。
①完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。
如HindⅢ和HsuI。
HindⅢ5’-AAGCTT-3’
3’-TTCGAA-5’
HsuI5’-AAGCTT-3’
3’-TTCGAA-5’
幻灯片18
②不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。
如XmaI和SmaI。
XmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’
SmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’
幻灯片19
（5）同尾酶（Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等
BamHI
5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
BglⅡ
5’-AGATCT-3’
3’-TCTAGA-5’
BclI
5’-TGATCA-3’
3’-ACTAGT-5’
5’-UGATCY-3’
3’-YCTAGU-5’
XhoⅡ
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
幻灯片20
Sau3A
5’-GATC----3’
3’----CTAG-5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。
？
GATCT-3’
A-5’
5’-G
3’-CCTAG
BamHI
BglⅡ
5’-GGATCT-3’
3’-CCTAGA-5’
BglⅡ
BamHI
Sau3A
幻灯片21
（6）限制酶的酶活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。
①星号（*）活性
如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。
幻灯片22
使用的时候要特别注意！
EcoRI和BamHI等都有*活性。
GAATTC
EcoRI：
在低盐、高pH（>8）时可识别和切割
GAATTA、AAATTC、GAGTTC等
7
幻灯片23
（7）Ⅱs型限制性内切酶
移动切割（shiftedcleavage）:
在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。
HgaI
GACGCNNNNN
5’
3’
CTGCGNNNNNNNNNN
幻灯片24
3.III类限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
EcoP1:
AGACC
EcoP15:
CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
幻灯片25
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性
I类内切酶
II类内切酶
III类内切酶
限制和修饰活性
单一多功能的酶
内切酶和甲基化酶分开
共同亚基的双功能酶
内切酶的蛋白结构
3种不同的亚基
单一成分
2种不同的亚基
限制作用所需要的辅助因子
ATP、Mg2+和SAM
Mg2+
ATP、Mg2+和SAM
寄主特异性位点识别序列
EcoB：
TGA（N）8TGCTEcoK：
AAC（N）6GTGC
回文序列
（IIs型除外）
EcoP1:
AGACC
EcoP15:
CAGCAG
幻灯片26
切割位点
在距离识别位点至少1000
bp处随机切开一条单链。
位于寄主特异性位点或其附近
距寄主特异性位点3‘端24—26bp处
酶催转换
不能
能
能
DNA易位作用
能
不能
不能
甲基化作用的位点
寄主特异性位点
寄主特异性位点
寄主特异性位点
识别未甲基化的序列进行切割
能
能
能
序列特异的切割
不是
是
是
基因工程中的用途
无用
十分有用
幻灯片27
三、限制性内切酶的命名
1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：
●用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；
流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。
幻灯片28
2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。
如EcoRI，EcoRV。
4.限制酶前面要带上R（Restriction），
修饰酶前面要带上M（Modification）。
（现已省略）。
幻灯片29
四、影响限制性内切酶活性的因素
1.DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
一般采取
①纯化DNA
②加大酶的用量
③延长保温时间
④扩大反应体积（>20l）
幻灯片30
2.DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；
dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。
幻灯片31
3.温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。
大多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适温度oC
酶
最适温度oC
酶
最适温度oC
ApaI
BclI
MaeII
TaqI
30
50
50
65
ApyI
BstEII
MaeIII
30
60
55
BanI
MaeI
SmaI
50
45
25
幻灯片32
4.缓冲液（Buffer）
是影响限制酶活性的重要因素。
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
（1）缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl：
提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：
保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：
有助于酶的稳定；
幻灯片33
五、限制性内切酶对DNA的消化
1.内切酶与识别序列的结合模式
1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。
GAATTC
CTTAAG
幻灯片34
2.完全消化
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
1
3
2
4
1
2
3
4
幻灯片35
3.局部消化
只有有限数量的酶切位点被切开。
1
3
2
4
1
4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
幻灯片36
4.限制酶酶切反应的终止
大多数酶可用65oC温育5分钟失活。
或用乙醇沉淀DNA。
5.几种常用限制酶识别位点
幻灯片37
幻灯片38
6.限制性内切酶识别序列的交叉列表
AATT
ACGT
AGCT
ATAT
CATG
CCGG
****
****
MaeII
HpaⅡc
MspIc
****
AluI
****
A****T
NlaⅢ
A****T
ApoI
HindⅢ
AflIII
AgeI
BsrFI
A****T
A****T
SspI
A****T
幻灯片39
AATT
ACGT
AGCT
ATAT
CATG
CCGG
A****T
Nsp7524
C****G
NcoI
StyI
DsaI
XmaI
AvaI
C****G
NdeI
C****G
PmlI
BsaAI
PvuII
NspBII
SmaI
C****G
C****G
G****C
EcoRI
ApoI
NgoMI
BsrFI
幻灯片40
AATT
ACGT
AGCT
ATAT
CATG
CCGG
G****C
BseHI
G****C
Ecl136II
EcoRV
NaeI
G****C
G****C
AatII
SacI
BanII
HgiAI
Bsp1286
SphI
Nsp7524
T****A
BspHI
BspMII
T****A
T****A
SnaBI
BsaAI
T****A
T****A
幻灯片41
CGCG
CTAG
GATC
GCGC
GGCC
****
MboIc
Sau3AIc
****
BfaI
HinpI
****
BstUI
DpnI
HaeIII
****
HhaI
A****T
A****T
MluI
AflIII
SpeI
BglII
BstYI
A****T
A****T
Eco47III
StuI
A****T
幻灯片42
CGCG
CTAG
GATC
GCGC
GGCC
A****T
HaeII
C****G
DsaI
AvrII
StyI
EagI
EaeI
GdiII
C****G
C****G
NspBII
C****G
SacII
PvuI
C****G
BsiEI
BsiEI
G****C
BssHII
NheI
BamHI
BstYI
KasI
BanI
Bsp120I
幻灯片43
CGCG
CTAG
GATC
GCGC
GGCC
G****C
NarI
BsaHI
G****C
G****C
G****C
T****A
BbeI
HaeII
ApaI
BanII
Bsp1286
T****A
XbaI
BclI
EaeI
T****A
NruI
FspI
MscI
T****A
T****A
幻灯片44
GTAC
TATA
TCGA
TGCA
TTAA
****
****
Csp61
TaqI
MseI
****
RsaI
****
A****T
A****T
A****T
ClaI
AseI
A****T
ScaI
A****T
幻灯片45
GTAC
TATA
TCGA
TGCA
TTAA
A****T
NsiI
C****G
BsiWI
SfcI
XhoIAvaI
AvaI
SfcI
C****G
C****G
C****G
C****G
PstI
G****C
Asp718BanI
SalI
ApaLI
幻灯片46
GTAC
TATA
TCGA
TGCA
TTAA
G****C
AccI
AccI
G****C
Bsrl107I
HincII
HpaI
HincII
G****C
G****C
KpnI
Bsp1286
HgiAI
T****A
T****A
BstBI
T****A
DraI
T****A
T****A
幻灯片47
第二节DNA连接酶
一、DNA连接酶（ligase）的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。
幻灯片48
二、DNAligase的特点
1.两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶
只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶
不但能连接粘性末端，
还能连接齐平末端。
幻灯片49
2.连接条件
（1）必须是两条双链DNA。
（2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量
动物或噬菌体中：
ATP
大肠杆菌中：
NAD+
幻灯片50
三、连接反应的机理
1.ATP（NAD+）提供激活的AMP。
2.AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。
3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。
ATP
PPi
+H3N
AMP
OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+
幻灯片51
4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。
AMP
-OH
HO-P-
AMP
-OH
O-P-
幻灯片52
5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。
幻灯片53
四、连接反应的温度
1.最佳温度
连接酶反应的最佳温度是37C。
2.实用温度
但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。
所以一般采用4~16C。
幻灯片54
五、影响连接反应的因素
1.插入片段与载体的浓度比例
10~20倍。
增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。
2.反应温度
12.5℃。
一般14~16℃
幻灯片55
第三节DNA聚合酶
一、基因工程中常用的DNA聚合酶
●大肠杆菌DNA聚合酶
●2.Klenowfragment
●3.T7DNA聚合酶
●4.T4DNA聚合酶
●5.修饰过的T7DNA聚合酶
6.逆转录酶
幻灯片56
二、常用的DNA聚合酶的特点
1.共同特点
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
2.主要区别
持续合成能力和外切酶活性不同。
T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。
其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
幻灯片57
3.常用DNA聚合酶的特性比较
DNA聚合酶
3’5’外切酶活性
5’3’外切酶活性
聚合速率
持续能力
大肠杆菌DNA聚合酶
低
有
中
低
Klenowfragment
低
无
中
低
T4DNA聚合酶
高
无
中
低
T7DNA聚合酶
高
无
快
高
化学修饰T7DNA聚合酶
低
无
快
高
遗传修饰T7DNA聚合酶
无
无
快
高
逆转录酶
无
无
低
中
TaqDNA聚合酶
无
有
快
高
幻灯片58
三、DNA聚合酶在基因工程中的用途
1.大肠杆菌DNA聚合酶I
主要用来制备带放射性标记的DNA探针。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质
①一条单链多肽。
②5’3’外切酶活性位于N端。
③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。
就成为Klenowfragment。
幻灯片59
（2）DNA聚合酶I（PolI）的反应条件
①底物：
dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）
②Mg2+
③带有3’—OH游离端的引物
④DNA模板
dNTPs
5’
-OH
3’
幻灯片60
（3）用DNA聚合酶I制备探针
①核酸探针（probe）
能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。
标记
已知序列的核酸片断
显示位置
与互补的待测序列杂交
幻灯片61
②探针的标记方式
5’
标记
已知序列的核酸片断
3’
标记
已知序列的核酸片断
带有放射性的已知序列的核酸片断
幻灯片62
③DNA聚合酶I对探针序列的标记
●放射性同位素标记：
切口转移法（nicktranslation）：
DNA聚合酶I同时具备5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。
幻灯片63
5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。
切口
切口
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
幻灯片64
纯化的DNA片断
5’
3’
3’
5’
3’
5’
DNaseI制造单链切口
5’
3’
32P-dNTP
3’
5’
一种-32P-dNTP和dNTPs
5’
3’
32P-dNTP
3’
5’
DNAPolI进行切口转移
3’
5’
从头至尾都被标记
8
幻灯片65
2.Klenowfragment
（1）Klenowfragment的性质
具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。
（失去了5’3’外切酶活性）。
枯草杆菌蛋白酶
DNAPolIKlenowfragment（76KD）
幻灯片66
（2）主要用途
①3’端补平
补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。
klenow
5’
5’
升级会员 