医疗器械检化员微生物培训.ppt

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微生物实验培训,一、人员资质及培训要求,从事医疗器械微生物检验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。

检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认它们可以承担某一检验前，他们不能独立从事该项微生物检验。

应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必须的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别试验人员的继续教育计划。

检验人员必须熟悉相关监测方法、程序、检验目的和结果评价。

微生物实验室的管理者其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符，如：

管理技能、实验室安全、检验安排、预算、实验研究、实验结果的评估和数据偏差的调查、技术报告书写等。

二、实验室环境控制,【原则】实验室布局设计的基本原则是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止检验过程对环境和人员造成危害。

通常，实验室应划分成洁净或无菌区域和活菌操作区域，同时应根据试验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的试验活动，将交叉污染的风险降低到最低。

一般情况下，医疗器械微生物检验的实验室应具有开展无菌检查、微生物限度检查等检测活动的、独立设置的洁净室（区）或隔离系统，并为上述检验配备相应的细菌（真菌）等实验室、培养室、文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。

二、实验室环境控制,【要求】1、无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。

用于无菌检查和微生物限度检查的洁净操作室应配有属于“人流净化”的更衣室及属于“物流净化”的缓冲间或传递窗（柜），使进入洁净操作室的实验人员和实验物品分别经适当净化后进入实验操作间。

无菌室分无菌操作室和缓冲间。

无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置。

操作室或工作台应保持正压。

应在压差十分重要的相邻级别区之间安装压差表。

二、实验室环境控制,【要求】2、微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。

因此，微生物限度检查宜在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行；限度检查实验室应配有相应的人流和物流缓冲间，并定期作环境监测。

二、实验室环境控制,【要求】3、菌种处理、微生物鉴别和阳性对照室菌种的处理包括的内容比较多，如菌种的传代、保藏、制备以及培养基促生长实验、阳性对照、微生物方法验证、消毒剂和防腐剂的效力测定和对环境中分离菌的鉴别等，这些实验过程中都在处理活的微生物，处理不当会造成实验室环境污染，影响其他实验结果，因此，该室必须与其他实验室严格分开；必要时，应按实验室性质的需要保持对相邻实验室的相对压差；需采取必要的消毒方式确保实验室洁净条件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以净化层流台作为局部100级的控制措施，最好是使用生物安全柜，所有的与活毒菌种相关的活动都应在层流台或生物安全柜中进行。

每次实验结束后要对层流台或生物安全柜及整个实验室环境进行消毒。

所有与菌种相关的实验废物均应经过灭菌处理后方可丢弃。

二、实验室环境控制,【要求】4、培养室及其他功能间培养室用于放置培养细菌和真菌的培养箱。

准备区即试液及培养基配制/灭菌区域、实验器皿洗涤、烘干、灭菌、实验用品及易耗品储藏等没有特殊要求的功能间，可为一般清洁环境。

微生物环境控制相关标准,GB/T16292:

2010，医药工业洁净室（区）悬浮粒子测试方法GB/T16293:

2010，医药工业洁净室（区）浮游菌测试方法GB/T16294:

2010，医药工业洁净室（区）沉降菌测试方法GB50073-2001洁净厂房设计规范ISO14644-1:

1999洁净室及相关受控环境第1部分：

空气洁净度等级划分ISO14644-4:

1999洁净室及相关受控环境第4部分：

设计、施工、运行ISO14644-7:

1999洁净室及相关受控环境第7部分：

分离的设备,无菌室环境控制设备,微粒计数仪,无菌室环境控制设备,浮游菌采样仪,无菌室环境控制设备,洁净室沉降菌测试方法,1.测试时间1.1对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。

1.2对非单向流，如10000级、100000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。

2.采样方法将已制备好的培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。

2.2.培养全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。

在3035培养箱中培养，时间不少于48h。

每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。

可每批选定3只培养皿作对照培养。

洁净室沉降菌测试方法,3.菌落计数用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用510倍放大镜检查，有否遗漏。

若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。

4.注意事项4.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。

4.2采取一切措施防止人为对样本的污染。

4.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。

4.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。

4.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。

洁净室沉降菌测试方法,5.测试规则5.1.测试状态5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。

5.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。

5.1.3测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。

5.2.测试人员5.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。

5.2.2静态测试时，室内测试人员不得多于二人。

最少采样点数目,同时满足最少平皿数,采样点的布置,采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。

a）工作区采样点的位置离地0.8m1.5m左右（略高于工作面）。

b）可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。

采样点位置的详细规则见附录B（标准的附录）。

采样点布置,环境检测参照标准,微生物实验室管理,严格区分污染区及清洁区,相关标准,GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准GB15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法和标准,三、灭菌控制,微生物实验使用的试剂、器材等常需用湿热灭菌法。

湿热灭菌的温度和时间需验证，必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL10-6。

灭菌程序经验证合格后方可使用。

定期进行BD实验、真空泄漏测试、温度参数测试（空载热分布、定载热穿透、满载热穿透）、压力改变速率测试（GB8599-2008大型蒸汽灭菌器技术要求），同时以生物指示剂验证灭菌效果,必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL小于百万分之一。

三、灭菌控制,所有器具应采用可靠方法灭菌置压力蒸汽灭菌器内12130min或置电热干燥箱内1802h。

湿热灭菌控制相关标准,GB18281.3-2000医疗保健产品灭菌生物指示物第3部分:

湿热灭菌用生物指示物ISO11138-3-2006医疗保健产品灭菌.生物指示物.第3部分:

湿热灭菌用生物指示剂,四、培养基管理,1、培养基的制备2、培养基的贮藏3、培养基的质量控制实验,四、培养基管理,灵敏度检查（中国药典2010）无菌检查（ISO11737.2:

2009或GBT19973.2-2005）,五、无菌操作,定义：

是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。

无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。

无菌操作技术主要包括两方面：

创造无菌的培养环境及在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入。

创造无菌的培养环境包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。

微生物实验前准备,微生物实验控制1：

人员管理微生物实验控制2：

环境控制微生物实验控制3：

灭菌控制微生物实验控制4：

培养基管理微生物实验控制5：

无菌操作,微生物基本操作,琼脂平板接种法琼脂斜面接种法半固体接种法肉汤培养基接种法,琼脂平板接种法,细菌在自然界及人体中分布广，种类多，为了了解菌谱，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步作细菌的鉴定。

琼脂平板培养基因面积大，接种后可达到分离的目的，常称分离培养法。

平板接种方法有多种。

以下介绍平行划线法及分区划线法。

琼脂平板接种法（分离培养法）,分区划线法,琼脂平板接种法（分离培养法）,平行划线法,琼脂平板接种法（分离培养法）,单个菌落,单个菌落,琼脂斜面接种法,目的：

多用于纯种细菌的增菌和保存菌种方法：

用灭菌接种环取细菌培养物少许。

拔去琼脂斜面培养基塞，管口经火焰上灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线；接种后，管口在火焰上灭菌，塞回塞，接种环灭菌：

在试管口处做好标记，置37培养1824小时,大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面,肉汤接种法,目的：

用于增菌。

方法：

用灭菌接种环取细菌培养物少许；以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌即可；接种后管口灭菌，塞回塞，接种环灭菌，并做好标记，置37培养18-24小时,半固体接种法（穿刺接种法）,目的：

增菌和保存菌种；观察细菌有无动力。

方法：

用接种针，将取有细菌的接种针自培养基中央刺入（不要接触管底），沿原穿刺线拨出，注意在刺入与拔出时不可晃动接种针；接种后做好标记。

置37培养18-24小时,半固体琼脂培养基（0.5%）,菌悬液制备（使用麦氏比浊管）,麦氏比浊管：

是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。

具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。

麦氏比浊管的配比,菌悬液制备（使用麦氏比浊管）,【材料】1、实验所需的微生物新鲜培养物如：

金黄色葡萄球菌新鲜培养物；2、无菌生理盐水、麦氏比浊管；3、酒精灯、接种环、无菌吸管、平皿。

菌悬液制备（使用麦氏比浊管）,【方法】1、轻摇标准试管；2、无菌操作挑取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至无菌生理盐水试管（与标准管相同直径）中混匀，直到浊度与所要求的标准管的浓度相同；3、序列稀释已挑取菌落的生理盐水试管至所需的菌液浓度如：

100cfu/ml;4、用平皿计数法验证所配置菌液的实际浓度。

菌悬液制备（使用麦氏比浊管）,【使用技巧】1、直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。

2、找张白纸打上平行直线，利用光在不同浓度液体折射不同帮助观察比较。

麦氏1号管稀释梯度表（cfu/ml）,菌悬液制备（使用分光光度仪）,分光光度仪,菌悬液制备的保存,菌悬液制备：

菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。

黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。

培养基质量控制：

灵敏度检查,灵敏度检查所需的六种菌：

金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003ATCC6538铜绿假单胞菌CMCC（B）10104ATCC9027枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501ATCC6633生孢梭菌CMCC（B）64941ATCC11437白色念珠菌CMCC（F）98001ATCC10231黑曲霉CMCC（F）98003ATCC16404根据培养基的功能选择灵敏度实验所需菌种,中国药典2005年版明确规定：

培养基灵敏度、微生物限度检查法检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

培养基质量控制：

灵敏度检查,中国药典2010年版在新增的