RNA提取标准流程Word下载.docx

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DEPC有致癌之嫌，需小心操作。

）

RNA的提取

准备试剂：

氯仿，异丙醇（可保存在-20º

C，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。

所有.溶液均需用0.05%DEPC处理过的水配制。

10×

Loadingbuffer（宝生物工程（大连）有限公司，货号：

D603，35元，1mL×

5支）

准备器材：

1mL、200μL枪头、小烧杯*3、1.5mLEppendorf管、2mLEppendorf管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。

操作步骤:

1.研磨+匀浆：

将组织在液氮中磨碎（大体积不均一的样品，如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体，必须对整个组织研磨），取50～100mg组织样品（肝脏可减少样品量到30mg）放入2mL离心管中，称重记录；

均一组织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。

每50～100mg组织加入1mLTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10%。

2．将匀浆样品在室温（15～30º

C）放置5min（可延长到15min），使核酸蛋白复合物完全分离。

可选步骤：

如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉）可于2～8℃10000×

g离心10min，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液转入2mL管中进行下一步操作。

3.每1mLTRIzol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡60s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置3min。

（可延长震荡时间和放置时间到15min，同GTC法）

4.4º

C10000×

g离心15min。

样品分为三层：

底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

（即1mL最多600µ

l，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层）

5.记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5mLEppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。

a.每使用1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇，室温放置10min。

b.可选：

应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）：

每使用1mLTRIzol在水相中加0.25mL异丙醇和0.25mL高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。

6.4º

g离心10min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。

弃上清。

8.向1.5mLEppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1mLTRIzol至少加1mL75%乙醇。

4℃不超过7500×

g离心5min，弃上清。

9.室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，大约晾5～10min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。

加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥0.5μg/μL，但不影响溶解，浓度在4μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情况），使之充分溶解（可选择4℃放置1h以上或55～65º

C水浴10min），之后才可以进行测浓度、DNA污染的PCR验证、RNA变性电泳等后续操作。

RNA应尽快转移至-70º

C保存。

也可用100%的去离子甲酰胺溶解（用于northern的RNA可这样保存于-20º

C）。

补充说明：

1.从少量样品（1～10mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许线性丙烯酰胺等助沉剂以促进RNA沉淀。

操作示例：

加800µ

LTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加浓度为5mg/mL的线性丙烯酰胺2～3μLRNase-free线性丙烯酰胺溶液。

它在使用时最终工作浓度应该为10～20μg/mL。

线性丙烯酰胺会与RNA一同沉淀出来，线性丙烯酰胺浓度不高于5µ

g/µ

L不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

线性丙烯酰胺制备方法见附录1。

2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70º

C保存至少一个月。

3.若提取的组织内源性RNAase含量较高（如胰腺），可将全部过程置于冰上操作，同时适当延长放置时间。

预期产量：

1mg组织或1×

106细胞提取RNA分别为：

A．检测吸光度时，RNA样品没有溶于TE，而溶于了水中，低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高，水中1.5～1.8的比值都可能是质量较好的RNA

B．样品匀浆时加的试剂量太少（造成蛋白未分离完全）

C．匀浆样品时未在室温放置5min

D．吸取水相时混入了有机相

E．RNA沉淀未完全溶解

RNA降解：

A．组织取出后没有马上处理或冷冻

B．待提取RNA的样品没有保存于-60至-70º

C，而保存在了-5至-20℃

C．细胞在用胰酶处理时过度

D．溶液或离心管未经RNase去除处理

E．电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

DNA污染:

A．样品匀浆时加的试剂量太少

B．样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲体系或碱性溶液

附录Ⅰ

一、线性丙烯酰胺制备方法

1.配5%的丙烯酰胺（acrylamide）溶液：

A．配制buffer100mL（40mMTris-HCl（pH=8），20mM醋酸钠,1mMEDTA）：

称取2.72g无水醋酸钠，溶于50mLDEPC水中，向其中加入1MTris-Cl（pH=8.0）4mL，0.5MEDTA（pH=8.0）0.2mL，加入盐酸调节pH至8.0，再加DEPC水至100mL。

B．称取5g丙烯酰胺，加入100mLbuffer中，高压灭菌后分装至高压过的1.5mL管中，每管0.2mL。

2.加过硫酸铵（AP）到终浓度为0.1%（w/v）：

A．配制10%AP储存液（w/v）：

称取0.1gAP，溶解于1mLDEPC水中。

B．向每管5%的丙烯酰胺溶液中加入2μL10%AP。

3.加TEMED到终浓度为1/1000（v/v），即向每管中加入0.2µ

LTEMED，室温聚合30min。

4.待溶液变粘稠，向管中加入2.5倍体积（500µ

L）的乙醇沉淀聚合物，-20℃沉淀30min以上。

5.12000×

g离心5min，沉淀即为线性的丙烯酰胺，每管加入1mL1×

TEbuffer溶解（溶解时间较长，可4℃过夜），即得到终浓度为10mg/mL的线性的丙烯酰胺1mL。

封口膜密封保存于-20℃，可保存2年。

1×

TEbuffer（10mMTris-Cl，pH=8.0；

1mMEDTA）配制方法：

加入1MTris-Cl（pH=8.0）1mL，0.5MEDTA（pH=8.0）0.2mL，加入DEPC水至100mL，高压灭菌备用。

6.使用时先加10～20µ

g（就是1～2µ

L）到核酸（RNA、DNA均可）溶液中，之后再加相应的盐溶液和异丙醇进行沉淀。

对于20nt以上的片段，号称可以无损回收pg级的核酸。

二、10×

MOPS（0.2MMOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸），50mMNaAc，10mMEDTA）配制：

先用800mLDEPC水溶解41.2gMOPS和6.8gNaAc•3H2O后，用10MNaOH（约7.2mL）调溶液pH值至7.0，加入20mL0.5mol/LEDTA，定容至1000mL。

用0.22mm滤器过滤除菌，装入棕色瓶中，室温避光保存。

三、EB（10mg/mL）配制：

称取0.2gEB溶解于20mL双蒸水中，充分混匀，装入棕色瓶中，于4º

C冰箱避光保存。