转氨作用实验报告.docx

转氨作用实验报告.docx

《转氨作用实验报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转氨作用实验报告.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

转氨作用实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除

转氨作用实验报告

　　篇一：

实验六纸层析法观察转氨基作用实验报告

　　实验六纸层析法观察转氨基作用

　　【实验名称】：

纸层析法观察转氨基作用

　　09救援一班第三大组李岚宇20XX222336

　　室温：

28°

（一）实验目的：

　　1、学习氨基酸纸层析的基本原理。

　　2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。

（二）实验原理：

　　转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。

转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。

氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。

各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：

　　α—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸

　　本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。

纸层析属于分配层析。

以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。

有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。

由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：

?

?

?

?

ALT

　　物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。

　　（三）实验材料与仪器：

　　试剂：

　　1、0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液。

　　2、0.2mol/Lna2hpo4溶液81ml与0.2mol/Lnah2po4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。

　　3（:

转氨作用实验报告）、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0nnaoh仔细调至ph7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。

　　4、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0nnaoh仔细调至ph7.4后，加磷酸盐缓冲液至100ml。

　　5、0.1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0nnaoh仔细调至ph7.4后,加磷酸盐缓冲液至50ml。

　　6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100ml丙酮中溶解。

　　7、层析溶剂：

将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。

　　仪器：

玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。

　　（四）实验步骤:

　　1、肝匀浆制备：

取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液1.0ml,迅速研成匀浆，用上述缓冲液4.5ml混匀备用。

　　2、酶促反应过程

（1）取离心管两支，编号：

1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0.5ml。

把对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。

（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液

　　1.5ml,摇匀。

　　（3）37℃保温，30分钟后取出，保温完毕。

　　（4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。

　　3、层析

（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。

（2）点样：

用四根毛细玻璃管分别进行点样。

把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。

把测定液、对照液分别点在原点1、3处。

注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。

在第一次点样点干后，再在原处同样点第2次。

　　（3）层析：

先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。

　　（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。

可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。

当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。

　　（5）显色：

将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。

　　（五）实验结果记录：

　　图

（1）

　　（六）实验讨论：

　　1、从表格

（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。

　　2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。

　　3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。

　　4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.

　　20XX年9月19日

　　篇二：

浙大生化实验报告氨基转换反应

　　实验报告

　　课程名称：

生化实验甲指导老师：

成绩：

__________________

　　实验名称：

氨基移换反应及其产物的鉴定实验类型：

同组学生姓名：

　　一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）

　　三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）

　　五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理

　　七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得

　　一、实验目的和要求

　　1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；

　　2、学习纸层析的原理和操作技术。

　　二、实验基本原理1.氨基移换反应：

　　在氨基移换酶（转氨酶）的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。

转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。

转氨酶的最适ph接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（gpT）和谷草转氨酶（goT）的活性最强。

　　转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。

在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase,gpT）、谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,goT）活性较高。

　　gpT催化下的转氨基反应为：

　　L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L－谷氨酸氧化脱－nh2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L－谷氨酸。

　　本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（gpT）的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。

　　2.纸层析原理：

　　滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。

利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。

　　层析溶剂是由有机溶剂和水组成。

滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。

进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。

易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。

　　用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/Lph7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。

　　3.茚三酮的显色原理：

　　氨基酸+茚三酮类紫红色复合物

　　三、实验材料与试剂

　　1、实验材料

　　动物肝脏（牛蛙肝或猪肝）

　　2、实验试剂

　　⑴0.01mol/L磷酸缓冲液（ph7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）；

　　⑵0.1mol/Lα－丙氨酸（ph7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）；

　　⑶0.1mol/Lα－酮戊二酸（ph7.4）（转氨基反应的底物）；

　　⑷0.1mol/L谷氨酸（ph7.4）（纸层析的标准样品）；

　　⑸展层溶剂－酚溶液：

水饱和酚：

冰乙酸（300：

1）（纸层析用）；

　　⑹10％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；

　　⑺0.25%碘乙酸（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性）；

　　⑻显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。

　　四、实验器材与仪器

　　⑴研钵；

　　⑵试管及试管架；

　　⑶恒温水浴箱（37℃、100℃）；

　　⑷铅笔、尺和圆规；

　　⑸毛细管（直径0.5mm）；

　　⑹新华定性滤纸（直径11cm）；

　　⑺剪刀和镊子；

　　⑻电吹风；

　　⑼滴管；

　　⑽康氏皿；

　　⑾喷雾器；

　　⑿烘箱（80℃）。

　　五、实验操作方法和步骤

　　1、转氨酶液的制备

　　取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。

　　2、氨基移换反应

　　取4支洁净、干燥的试管，按下表操作

　　3、层析

　　⑴准备：

　　①取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。

找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约0.2cm）。

　　②另取2cm×3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。

　　⑵点样：

用毛细管依次点标准α－丙氨酸（Ala）、谷氨酸（glu）各点2次，其余1－4号管样液各点2～3次。

点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。

　　⑶展层、显色

　　将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中,平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。

展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm（约需半小时），取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮－乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘箱（80℃）中显色3min。

　　（4）预计结果

　　六、结果分析

　　由实验结果可知，1与3所点的样显然受到了谷氨酸的污染，原因可能为：

1、点样的时候用的毛细管可能受到了污染；2、滤纸在点样之前可能碰到了桌面上的一些小液滴。

　　七、讨论、心得

　　1、避免污染滤纸，不要用手接触。

　　2、点样时，毛细管与滤纸轻微接触，不要留下痕迹。

　　3、喷茚三酮显色时，需要戴手套，免得手部被染色。

　　4、实验过程中尽量保持台面干净，免得污染滤纸。

　　篇三：

实验四转氨基作用

　　实验四转氨基作用（纸层析法）

　　原理

　　氨基酸分子上的氨基转移到α-酮酸分子上的反应过程称为转氨基作用（或称氨基移换作用）。

转氨基作用是氨酸代谢的重要反应之一，由转氨酶催化。

经转氨后，原来的α-—氨基酸变成了相应的α-—酮酸，原来的α-—酮酸则成为新的、相应的α-—氨基酸。

　　本实验观察谷氨酸与丙酮酸在肌匀浆中的谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称gpT）的催化进行转氨基的过程。

然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的