植物细胞组织培养的基本技术总结版.docx

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植物细胞组织培养的基本技术总结版

本章主要内容

●商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备

●培养基及其配制

●外植体的选择与培养

●试管苗的驯化与移载

第一节商业性组织培养实验室和小工厂

的设计与主要设备

●培养皿的清洗；

●培养基的配制、分装和高压灭菌；

●无菌操作——材料的表面灭菌和接种；

●将培养物放到培养室培养；

●试管苗的驯化、移栽和初期管理。

（一）、洗涤室（cleaningroom）

●洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。

●室内配备：

●大型水槽，最好是白瓷水槽。

为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。

上下水道要畅通。

●备有塑料筐，用于运输培养器皿。

●备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。

（二）、准备室（repairingroom）

●完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。

准备室要求明亮、通风。

●如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。

洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。

（三）、缓冲室

●进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。

●应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。

控制无菌室及培养室的配电板等。

（四）、无菌操作室（transferingroom）

●接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。

其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。

●配置：

●在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。

配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。

●接种室要求干爽安静，清洁明亮。

在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。

最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。

（五）、培养室（culturingroom）

●培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。

培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。

●设计原则：

●充分利用空间和节省

●能源

●高度比培养架略高为

●宜

●周围墙壁要求有绝热

防火的性能。

（五）、培养室（culturingroom）

●培养架大多由金属制成。

●规格：

●一般设5层，最低一层离地高约10cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。

培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长1m，宽度一般为60cm。

●培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。

由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。

室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。

●控制日光照时间可安装定时开

关钟，一般需要每天光照10-16h。

也有的需要连续照明。

现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。

（六）、驯化室

●驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。

（七）、温室

●应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。

二、仪器设备和器皿用具

●常见仪器设备

●1、超净台

●2、无菌箱

●3、空调机

●4、除湿机

●5、恒温箱

●6、烘箱

●7、高压灭菌锅

●8、冰箱

●9、电子分析天平和托盘天平

●10、显微镜及解剖镜

●11、水浴锅

●12、摇床与转床

●13、磁力搅拌器

●14、电蒸馏水器

●15、酸度计

●16、离心机

1、超净台和无菌箱

●1、超净台，优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。

开机10分钟即可操作，可进行长时间使用。

在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。

●2、无菌箱，在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。

接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。

但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。

工作原理

●超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于0．3um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。

超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。

在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。

●根据风幕形成的方式，超净台可分为水平式和垂直式二种型号。

（二）各类玻璃器皿

1、培养器皿

2、分注器

3、离心管

4、刻度移液管

5、细菌过滤器

6、实验器皿

1、培养器皿

●1、培养器皿：

在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。

要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。

其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。

●最常使用的是

●三角瓶

●培养皿（9、12cm直径）用于：

游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。

●试管（18mmXl80mm或20mmX200mm）用于：

培养较高的试管苗。

●工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。

但缺点是易引起污染。

瓶口封塞

●瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。

●以前封口常用棉塞。

但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。

现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。

为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。

这样经济方便，且通气好。

也可采用专用的封口膜。

5、细菌过滤器

●用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。

一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭菌。

包括滤头，注射器或采用抽滤装置：

真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。

6、实验器皿

●在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括:

●100ml、250ml、500ml、1000ml烧杯；

●l0ml、l00ml、1000ml量筒；

●l00ml、1000ml试剂瓶（棕色）等等。

（三）、器械用具（P13）

●1．镊子类：

尖头和枪形

●2．剪刀类

●3．解剖刀

●4．解剖针

●5、接种工具：

接种针、接种钩及接种铲（由白金丝或镍丝制成）

●6、钻孔器

●7、其它：

酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等

第二节培养基及其配置

●目的要求：

●

（1）一般掌握培养基的种类、特点；

●

（2）掌握基本培养基的配方；

●（3）一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；

●（4）掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；

●（5）熟练掌握培养基的灭菌方法；

●（6）一般掌握培养基的筛选办法。

培养基及其配制

●培养基的种类

●培养基的成分

●培养基配制

1.培养基的种类

●按成分分类:

●MS,B5,White,NT,KM-8P,N6等。

●按状态：

液体，固体。

（1）MS培养基（MurashigeandSkoogMedium）

MS培养基（MurashigeandSkoogMedium）

●ToshioMurashige,FolkeSkoog.ARevisedMediumforRapidGrowthandBioAssayswithTobaccoTissueCultures.Physiol.Plant.1962,15:

473-497.

●植物组织培养中常用的一种培养基。

●离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基高。

●器官，花药，细胞，原生质体培养。

（2）B5培养基（B5Medium）

●Gamborg,O.L.;Miller,R.A.;Ojima,K.Nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells.Exp.CellRes.50:

151–158;1968.

B5培养基（B5Medium）

●铵含量较低

●木本植物，十字花科植物

（3）White培养基（WhiteMedium）

●White,P.R.Handbookofplanttissueculture.NewYork:

TheRonaldPressCo.;1943.White,P.R.;Grove,A.R.Proceedings,InternationalConferenceonPlant

●TissueCulture（1963:

UniversityPark,PA）.Berkeley,CA:

McCutchanPub.Corp.;1965:

553pp.

●无机盐含量低

●生根培养

（4）NT培养基（NTMedium）

●1970

●烟草叶肉原生质体培养

（5）KM-8培养基（KM-8Medium）

●1974

●有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，呼吸代谢主要有机酸

●原生质体和融合体培养

（6）N6培养基（N6Medium）

●1974，朱至清等。

●成分简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高

●小麦，水稻及其他植物花药培养和组织培养

2.培养基的成分

●水

●无机营养成分

●有机营养成分

●植物生长调节剂

●附加成分

（1）水

●培养基的主要组分

●水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。

●配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。

大规模生产时可用自来水。

（2）无机营养组分

●作用

●满足植物对各矿质元素的需求。

●大量元素，6种

●微量元素，7种

●非必须元素，6种

铁采用螯合铁，FeSO4加EDTA

（3）有机营养成分

●碳源

●蔗糖

●维生素类

●硫胺素（B1），烟酸（B3），吡哆醇（B6），泛酸钙（B5），肌醇。

●氨基酸

●蛋白质组成成分，促进细胞生长。

●其他有机附加物

●椰子汁，酵母提取物，马铃薯，水解酪蛋白等。

可以促进组织生长。

●椰子汁

●椰子的液体胚乳。

它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。

一般使用浓度在10%-20%。

它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。

●马铃薯

去掉皮和芽后，加水煮30分钟，再经过过滤，取其滤液使用。

对PH值缓冲作用大。

添加后可得到健壮的植株。

其他

●酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。

（4）植物生长调节物质

●生长素

●细胞分裂素

●赤霉素

●乙烯

生长素﹑赤霉素﹑细胞分裂素﹑

脱落酸﹑乙烯

-------植物激素“五兄弟”

●生长素（auxin）的发现

向光性：

在单侧光的照射下，植物朝向光源方