法国梧桐叶与果.docx

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法国梧桐叶与果

材料与方式

材料与试剂

法国梧桐叶、法国梧桐落果收集于新乡市洪门镇。

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、无水乙醇、钨酸钠、磷钼酸均为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸分析纯（中国莱阳市双双化工有限公司）；AlCl3（10%）；CH3COOK（1M）；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）为Sigma公司产品；DMSO（二甲基亚砜）；FeSO4•7H2O（10mM）；EDTA（乙二胺四乙酸酸根离子,10mM）；2-脱氧核糖（10mM）；磷酸盐缓冲液（M，）；H2O2（10mM）；TCA（三氯乙酸%）；TBA（二硫代巴比妥酸1%）；磷酸盐缓冲液（）；K3Fe（CN）6（铁氰化钾，1%）；TCA（三氯乙酸10%）；FeCl3%）；蒸馏水实验室自制。

仪器与设备

KQ-500B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；DHG-9070型电热古风恒温干燥箱上海市三发科学仪器有限公司；BS124S电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-8型水浴锅金坛市杰瑞尔电器有限公司；HH-S精密数显恒温水浴锅常州市国立实验设备研究所；WB-2002水浴锅郑州长城科工贸有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司；AnkeTGL-16B型台式离心机上海安亭科学仪器厂；SHB-III型循环水式多用真空泵郑州国瑞仪器有限公司；低温冷却循环泵郑州长城科工贸有限公司。

实验方式

提取与萃取

将粉碎好的法国梧桐叶和果实别离乘装于10L广口瓶内，用90%乙醇和95%乙醇溶液浸泡于50℃恒温水浴锅中，加热回流提取24h。

对提取液用旋转蒸发仪进行浓缩蒸干，以上进程重复三次，得法国梧桐叶和果实提取物，再别离向法国梧桐叶和果实提取物中加入水，以正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇的顺序按1:

1的比例进行萃取；每种溶剂萃取三次，最后取得水层。

去除溶剂取得的法国梧桐叶和果实提取物和各层萃取物组分。

DPPH自由基清除能力的测定

原理：

DPPH自由基是一种比较稳固的自由基，在517nm处有最大吸光度,其醇溶液呈紫色。

当它碰到自由基清除剂时，与自由基清除剂配对，化合物溶液从紫色变成淡黄色。

现在，DPPH基团在517nm处的吸光度减小，由于褪色程度与电子数量成定量关系，因此能够通过测定加入样品时的517nm下的吸光度转变，从而求得该样品对自由基的消除率[1]。

样品对DPPH自由基的清除能力依据Yen和Chen（1995）[2,3]的方式修改后来测定样品清除DPPH自由基的能力。

即Ao:

mLmmol/L的DPPH甲醇溶液+mL试样溶剂，Ai：

mLmmol/L的DPPH甲醇溶液+mL待测样品溶液，Aj:

mL样品溶液+mL试样溶剂,混合均匀后室温下于暗处静置30min，然后在517nm处测定吸光度。

由下面的方程式

（1）计算样品对DPPH自由基的清除能力：

消除效率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100％

（1）

其中：

A0为对照组的吸光度

Ai为测试组的吸光度

Aj为空白组的吸光度

方式：

将正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层和95%乙醇层待测样品别离配制成25、50、100μg/mL的一系列溶液，然后配制Ao、Ai、Aj，最后测定对应待测样品浓度的吸光度，每一个样品的每一个浓度重复3次。

计算DPPH自由基清除率和不同层样品对DPPH自由基清除能力的EC50值，并绘制DPPH自由基清除率对样品浓度柱状图。

羟基自由基消除能力的测定

原理：

Fe3+的螯合物（如Fe-EDTA）存在下的Fenton型Haber-Weiss反映可产生·OH，反映方程式为：

Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH工艺上将Fe2+和H2O2的组合成为Fenton试剂[4]。

反映生成的羟基自由基能够进攻2-脱氧核糖，使其降解生成丙二醛。

氧化产物丙二醛能够与硫代巴比妥酸进行显色反映，生成粉红色物质在532nm处有最大光吸收。

若是在溶液体系中加入具有清除·OH功能的被测物质，它能够与2-脱氧核糖竞争羟基，使产生的红色物质减少，即532nm处的吸光度减小。

因此能够通过测吸光度间接测其对羟基自由基的清除作用[5]。

由下面的方程式

（2）计算样品对羟基自由基的清除作用：

消除效率（%）=（1-As/Ao）×100％

（2）

其中：

As为待测溶液的吸光度

Ao为对照组溶液的吸光度

方式：

将正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层和95%乙醇层待测样品别离配制成250、500、1000μg/mL的一系列溶液，前后依次加入100μL的FeSO4·7H2O、EDTA、2-脱氧核糖、100μL各浓度的样品溶液（空白对照组加入100μL样品溶剂水）、500μL磷酸缓冲溶液，100μLH2O2于试管中,于37℃水浴加热4小时。

然后加入三氯乙酸（TCA）、二硫代巴比妥酸（TBA）各500μL。

以后将它们放在100℃恒温水浴锅中加热十分钟后，冷却至室温后在3000rpm下离心5分钟。

最后别离测定各样品在532nm下的吸光度，每一个样品的每一个浓度重复3次。

计算对应待测样品浓度时其对羟基自由基的清除率，并绘制清除率对样品浓度柱状图。

还原能力测定

在还原能力测定实验中，来自样品中的抗氧化剂能将铁氰化钾中的Fe3+还原成Fe2+，Fe2+进一步生成在700nm处有最大吸光值的Perl普鲁士兰，因此测定700nm处吸光值的高低能够间接反映抗氧化剂还原能力的大小[6]。

将法国梧桐落果提取物样品配制成系列浓度：

250、500、1000μg/mL，别离移取各浓度的样品mL于试管中加入磷酸盐缓冲液（pHmL再加入1%铁氰化钾溶液mL在50℃下反映30分钟。

然后加入10%三氯乙酸溶液mL充分混和均匀，3000rpm下离心10分钟。

移取上清液mL于试管中，加入蒸馏水，再加入%三氯化铁mL，常温下反映5分钟，然后利用紫外可见分光光度计于700nm波长下测定吸光值。

同时做空白对照组，不加样品，加入mL蒸馏水。

按照各反映组吸光度的高低评价法国梧桐落果95%乙醇提取物、各萃取层和法国梧桐叶子90%乙醇提取物、各萃取层的抗氧化能力。

吸光度越高表示还原能力越强。

2.结果与分析

法国梧桐果实实验结果：

DPPH自由基清除能力的测定结果及讨论

1）样品对DPPH自由基的清除率数据见表1：

表1样品对DPPH自由基清除率（%）数据

样品

25μg/mL

50μg/mL

100μg/mL

95%EtOH萃取物

C6H14萃取物

CH2Cl2萃取物

EtOAc萃取物

BuOH萃取物

H2O萃取物

2）样品对DPPH自由基清除能力柱形图见图1

图1DPPH自由基清除能力柱形图

能够看出，各个萃取层的DPPH清除能力均随着浓度的增加而增强。

其中95%EtOH层，MC层，EA层和Bu层随浓度转变效果明显，100ppm均比50ppm增加10%以上，EA层达到了%。

MC层、EA层、Bu层，DPPH自由基清除能力整体随着极性的增加而增加，Bu层的50ppm比25ppmDPPH自由基清除能力有显著的提高，达到%。

由此可见Bu层有必然的科研价值，值得进行深切研究。

还原能力测定结果及分析

1）不同层样品还原能力的测定数据见表2

表2样品的还原能力的测定数据

样品

250μg/mL

500μg/mL

1000μg/mL

95%EtOH提取物

C6H14萃取物

CH2Cl2萃取物

EtOAc萃取物

BuOH萃取物

H2O萃取物

不同层样品还原能力的测定柱形图见图2

图2样品还原能力的测定柱形图

从表中和图中能够看出来95%EtOH层、Mc层、EtOAc层、Bu层的还原能力较强，而且随着浓度的加大，其还原能力也随之增强，其中Mc层和EtOAc层的还原能力较为突出。

水层的还原能力较弱，且随浓度的加大其还原能力大体维持不变，可能是前几个萃取层对具有还原能力的化学物质萃取的效果比较充分。

其中，Mc层和EtOAc层相对于其他各萃取层有必然的研究价值。

不过整体来讲比较国内外文献，还原能力偏弱。

羟基自由基消除能力的测定结果与分析

1）不同层样品羟基自由基消除能力的测定数据见表3

表3样品对羟基自由基清除率（%）数据

样品

250μg/mL

500μg/mL

1000μg/mL

95%EtOH提取物

C6H14萃取物

CH2Cl2萃取物

EtOAc萃取物

BuOH萃取物

H2O萃取物

2）不同层样品羟基自由基消除能力的柱形图见图3

图3样品羟基自由基清除能力测定柱形图

从表3和图3能够看出，各个萃取层对羟基自由基的消除能力均随着样品浓度的增大而增强。

且除95%EtOH层外，从H层到W层，各萃取层的对羟基自由基的消除能力有下降趋势。

95%EtOH层对羟基自由基的清除能力效果最好，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL对羟基自由基的清除能力别离达到%，%，%。

且H层，Mc层，EA层对羟基自由基的消除能力相差不大，能够进一步深切研究。

法国梧桐叶的研究实验结果

DPPH自由基清除能力的测定结果及讨论

1）样品对DPPH自由基的清除率数据见表1：

表1样品对DPPH自由基清除率（%）数据

样品

50μg/mL

100μg/mL

250μg/mL

500μg/mL

1000μg/mL

EtOH提取物

H萃取物

Mc萃取物

EA萃取物

Bu萃取物

W萃取物

2）样品对DPPH自由基清除能力柱状图见图1

图1DPPH自由基清除能力柱状图

由上图能够看出，各个萃取层样品的DPPH自由基清除能力随浓度的增加而增加，且在50μg/mL是各层样品的清除能力相差不大。

EtOAc层、Bu层，和W层样品的DPPH自由基清除能力随浓度转变明显，在1000μg/mL浓度时有较高清除效率，别离为%、%、%。

还原能力测定

1）不同层样品还原能力的测定数据见表2

表2样品的还原能力的测定数据（吸光度）

样品

50μg/mL

100μg/mL

250μg/mL

500μg/mL

1000μg/mL

EtOH提取物

H萃取物

Mc萃取物

EA萃取物

Bu萃取物

W萃取物

2）不同层样品还原能力的测定柱状图见图2

图2样品还原能力的测定柱状图

依据表格和柱状图得出，各个萃取层样品还原能力随浓度增加而逐渐增强。

H层样品增加缓慢，吸光度从50ppm时转变为1000ppm时的。

从50ppm到250ppm，Mc层无明显增强，但从250ppm转变到1000ppm，Mc层还原能力明显增强。

EtOH层样品的还原能力随浓度增加,增加明显，吸光度从50ppm的转变到1000ppm的。

除此之外EtOAc层，Bu层与Ｗ层样品均在50ppm到100ppm浓度转变时还原能力增加不明显，再随浓度增加，还原能力显著增强。

羟基自由基消除能力的测定

1）不同层样品羟基自由基消除能力的测定