三微生物限度检查法Word下载.docx

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水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

2.固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。

必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

3.需用特殊供试液制备方法的供试品

（1）非水溶性供试品

方法1取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。

方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录ⅩⅢB无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。

然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。

（2）膜剂供试品

取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。

（3）肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1∶10的供试液。

（4）气雾剂、喷雾剂供试品

取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。

用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。

（5）贴膏剂供试品

取规定量供试品，去掉贴膏剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。

用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。

然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，制成供试液。

贴膏剂也可以其他适宜的方法制备成供试液。

（6）具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。

常用的方法如下。

①培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。

测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。

每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；

控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

②离心沉淀法取一定量的供试液，500转/分离心3分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。

③薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。

④中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。

中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

细菌、霉菌及酵母菌计数

计数培养基的适用性检查

细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。

菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）。

试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕

白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕

黑曲霉（Aspergillusniger）〔CMCC（F）98003〕

菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。

上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

适用性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；

取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；

取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

结果判定被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

判该培养基的适用性检查符合规定。

计数方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。

若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。

对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查

验证方法验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

（1）试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。

（2）菌液组测定所加的试验菌数。

（3）供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

（4）稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。

试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。

若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；

若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法（表1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

表1常见干扰物的中和剂或灭活方法

干扰物

可选用的中和剂或灭活剂

戊二醛

亚硫酸氢钠

酚类、乙醇、吸附物

稀释法

醛类

稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐

季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯、

卵磷脂、聚山梨酯

汞类制剂

亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐

双胍类化合物

卵磷脂

碘酒、洗必泰类

聚山梨酯

卤化物

硫代硫酸盐

乙二胺四乙酸（EDTA）

镁或钙离子

磺胺类

对氨基苯甲酸

β-内酰胺类抗生素

β-内酰胺酶

若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。

但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。

因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。

若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。

计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。

验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

供试品检查

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。

检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。

按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。

用稀释液稀释成1∶10、1∶10

2、1∶103等稀释级的供试液。

1.平皿法

取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。

每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天。

逐日观察菌落生长情况；

点计菌落数。

必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。

菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。

点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数；

玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。

在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。

然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。

菌数报告规则细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1mL或10cm2供试品中所含的菌数。

如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

2.薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm，若采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。

选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。

滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。

使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。

油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。

供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤；

若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。

用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。

冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。

每种培养基至少制备一张滤膜。

阴性对照试验取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。

阴性对照不得有菌生长。

培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。

菌数报告规则以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；

若滤膜上无菌落生长，以<

1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品），或＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

控制菌检查

控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。

检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。

菌种对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）〔CMCC（B）50094〕

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）〔CMCC（B）10104〕

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）〔CMCC（B）64941〕

菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。

适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查所用的菌株及检测项目见表2。

表2控制菌检查用培养基的促生长、抑制和指示能力检查

培养基

特性

试验菌株

大肠埃希菌

胆盐乳糖培养基

MUG培养基

曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

金黄色葡萄球菌

大肠菌群

乳糖胆盐发酵培养基

乳糖发酵培养基

沙门菌

营养肉汤

四硫磺酸钠亮绿培养基

胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂

乙型副伤寒沙门菌

铜绿假单胞菌

溴化十六烷基三甲铵琼脂

绿脓菌素测定用培养基

亚碲酸盐肉汤培养基

卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂

梭菌

梭菌增菌培养基

哥伦比亚琼脂

生孢梭菌

白色念珠菌

沙氏葡萄糖肉汤

沙氏葡萄糖琼脂

念珠菌显色培养基

吐温80玉米琼脂培养物

增菌培养基促生长能力检查：

分别接种不大于100cfu的试验菌（见表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生长能力检查：

取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。

被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。

培养基抑制能力检查：

接种不少于100cfu的试验菌（见表2）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。

固体培养基指示能力检查：

取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见表2）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。

被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

液体培养基指示能力检查：

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。

控制菌检查方法的验证

当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。

若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。

验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。

验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。

菌种及菌液制备同控制菌检查用培养基的适用性检查

验证方法

取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

结果判断若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；

若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。

阳性对照试验供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。

阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，方法同供试品的控制菌检查。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

阴性对照应无菌生长。

（1）大肠埃希菌（Escherichiacoli）取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；

不呈现荧光，为MUG阴性。

观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；

呈试剂本色，为靛基质阴性。

本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；

如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；

如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。

若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。

表3大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润

（2）大肠菌群（Coliform）取含适量（不少于10ml）的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1∶10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1∶100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1∶1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。

培养18～24小时。

乳糖胆盐发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；

若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表4所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；

若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。

表