低分子肝素预处理对大鼠急性肺损伤的影响文档格式.docx

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【Keywords】acutelunginjury;

pretreatmentofLMWH;

inflammatorymediator;

adhesionmolecular;

coagulationandfibrinolysis;

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是常见的威胁生命的急性呼吸衰竭。

虽然肺保护性通气策略在一定程度上改善了死亡率，但是发病率和死亡率仍很高。

为了寻找新的有效治疗方法，许多研究者开始研究凝血和纤溶在ALI/ARDS病程进展中的作用。

ALI/ARDS病人常常需要机械通气和长期卧床，深静脉血栓的发生率很高，这时总需要应用LMWH来改善这种高凝状态。

LMWH既有抗凝作用，又具有一定的抗炎效应，为此我们建立大鼠脂多糖致ALI模型，探讨LMWH预处理对ALI的影响。

材料和方法

动物选择与分组成年SD大鼠50只（北京大学医学部动物实验中心提供），随机分为5组，盐水对照组（C组），急性肺损伤组（ALI组），LMWH100u/kg预处理组（LMWH100组），LMWH200u/kg预处理组（LMWH200组）和LMWH300u/kg预处理组（LMWH300组），每组10只。

动物模型制备术前不禁食水，用75%的乙醇消毒腹部，腹腔内注射LPS（Sigma公司）6mg/kg（用生理盐水稀释至2ml），制备大鼠ALI模型，4小时后用1%戊巴比妥钠5mg/kg麻醉，处死动物，采集标本。

LMWH预处理组在ALI模型制备前2小时经皮下分别注射LMWH100u/kg、200u/kg和300u/kg，注射LPS后4小时处死动物。

正常对照组腹腔内注射2ml生理盐水，4小时后采集标本。

标本采集处死动物后开胸，钳夹大鼠右侧四个肺叶，第一二个肺叶放于液氮中速冻后，保存于-70℃冰箱中，用于进行肺组织MPO活性和TNF-α含量以及肺组织mRNA表达水平的测定；

第三个肺叶用于肺湿干重比的测量；

第四个肺叶保存于10%甲醛中，做病理学切片；

用预冷的PBS缓冲液经右心室进行肺循环灌注直至左侧肺叶表面变白，切开气管置入14G套管针，结扎固定，用12ml预冷PBS缓冲液分4次进行支气管肺泡灌洗，收集每次的灌洗液（BALF），2000rpm离心5min，将上清保存于-20℃，用于BALF总蛋白浓度的测量。

指标测定

（1）肺组织病理切片：

用10%甲醛固定肺组织，脱水，透明，苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜（Olympus公司）下观察肺组织的病理学改变。

（2）肺组织湿干重比（W/D）：

取右肺第三肺叶，剔除多余结缔组织，拭干表面血液，用天平精确称量其重量（W），放入80℃烤箱烘烤48小时后，再次称量其重量（D），从而得到肺组织湿干重比（W/D）。

（3）MPO试剂盒（南京建成生物公司）测定肺组织MPO活性：

取适量肺组织准确称重，使用组织匀浆机（江苏其林医用仪器厂GF-1型）在冰上制备5%组织匀浆（“1”档，5秒/次×

3次）（匀浆缓冲液由试剂盒提供），按试剂盒说明依次加入试剂并孵育，使用紫外分光光度计（日本岛津公司UV2100型）在460nm处测量测定管和对照管的OD值。

MPO活性（U/g）＝（测定管OD值－对照管OD值）/11.3×

取样量（g）。

（4）BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术公司）测量BALF中的总蛋白浓度：

以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，进行梯度稀释（浓度范围0~500μg/ml），取20μl样本和不同浓度标准品加到96孔板中指定孔中，向各孔加入200μlBCA工作液（按50:

1比例混合试剂A和试剂B配制而成），37℃孵育30min，测定各孔在620nm处（Biorad550型酶标仪）的OD值。

在Excel软件中，根据标准品各浓度与OD值建立标准曲线（总蛋白浓度=3907.6×

OD620－773.33，R2=0.981），将样本OD值带入标准曲线方程，计算出样本的总蛋白浓度。

（5）大鼠TNF-αELISA试剂盒（BenderMedSystems公司，Austria）测定肺组织TNF-α水平：

取适量肺组织（80-100mg），加入3ml匀浆缓冲液（）（0.5%Triton-X-100，150mMNaCl，15mMTris，1mMCaCl2和1mMMgCl2，pH=7.4），使用组织匀浆机在冰上制备组织匀浆（“1”档，5秒/次×

3次），10000rpm离心15min（4℃），取上清测量TNF-α的浓度（按说明书操作），在酶标仪上读取409nm的OD值。

用BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术公司）测定上清液中总蛋白浓度，计算出每mg肺匀浆蛋白中TNF-α的含量。

（6）PT、APTT和血浆纤维蛋白原水平：

实验大鼠麻醉后开胸，从右心室抽血2.7ml（注射器中预先加入0.109mol/L枸橼酸钠0.3ml）,上下颠倒4次混匀后静置15分钟，用ACL9000凝血功能分析仪测定血浆PT、APTT和纤维蛋白原水平。

（7）SYBRGreen实时定量RT-PCR测定肺组织ICAM-1、E-selectin、TF和PAI-1mRNA的表达：

Trizol法（Invitrogen公司）提取肺组织总RNA，用紫外分光光度计测量260nm和280nm处的OD值，计算出样本的纯度和RNA浓度。

用无RNA酶DNA酶Ⅰ（Promega公司）去除RNA中可能含有的DNA污染，加入Oligo（dT）15引物（Promega公司）、M-MLV反转录酶（Promega公司）和dNTP（华美公司）等试剂合成cDNA，然后进行PCR反应。

PCR引物设计和扩增片断大小见表一（由北京赛百盛公司合成）。

PCR反应混合液（SYBRGreenRealtimePCRMasterMix）购自TOYOBO公司。

25μlPCR反应体系：

灭菌注射用水9μl，上下游引物混合液（5pmol/L）1μl，PCRMasterMix12.5μl，cDNA模板2.5μl。

反应条件：

95℃60秒，95℃15秒→60℃60秒（40个循环）。

用2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，在紫外观测灯下观察并切下电泳条带，用玻璃奶回收纯化PCR产物，溶于TE缓冲液中，-20℃保存。

在7300实时定量PCR仪（ABI公司，美国）上进行PCR反应：

梯度（1:

10）稀释标准品（1:

10~1:

106），并将其浓度记为106、105、104、103、102和10。

取2.5μl不同浓度标准品和样本cDNA加到PCR96孔板的指定孔中，继续加入反应体系中的其它反应物，按上述反应条件进行PCR反应。

根据标准品的浓度和荧光读数建立标准曲线，计算出样本的浓度。

以粘附分子和细胞因子与β-actin浓度的比值作为表达水平的相对定量。

将C组的比值记作1，计算其它各组mRNA的表达相对于C组增加的倍数。

表1PCR引物序列

引物

序列5’to3’

扩增片断大小（bp）

Beta-actin

F:

5'

-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3'

R:

-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'

101

ICAM-1

5’-AGCTCTTCAAGCTGAGCGACAT-3’

5’-ACTCACTCTGGGAACGAATACA-3’

118

E-selectin

-CACGGTGAATGCGTTGAGAC-3'

-GGCTTCCATGGTCAGGGTATT-3'

121

TF

5’-TTGTGGGAGCAGTGGTGTTC-3’

5’-GCGTCAGCCTCCTCGTCTAT-3’

138

PAI-1

5’-TGGAGAGGCACACCAAAGGTAT-3’

’-CCTCTAAGAAGGGGGTCTTCCA-3’

126

统计学处理:

数据以均数±

标准差（x±

s）表示,用SPSS11.0统计分析软件对数据进行处理,组间比较采用单因素方差分析和q检验,P<

0.05为差异有统计学意义。

结果

肺组织病理切片检查：

C组肺组织结构清晰、肺泡壁完整，肺间质和肺泡腔无渗出（图1）。

ALI组肺组织结构紊乱，肺间质明显充血水肿，肺泡腔塌陷（图2）。

三个LMWH预处理组中，LMWH100组可以看到间质的充血水肿明显减轻（图3），而LMWH200组（图4）和LMWH300（图5）并未观察到明显的病理改变。

肺湿干重比和BALF总蛋白浓度的变化：

与C组比较，ALI组这两个指标均显著增加（p<

0.05）。

LMWH200和LMWH300组的肺湿干重比与ALI组的差异有统计意义（p<

见表2。

LMWH预处理组的BALF较ALI组差异无统计学意义（p>

0.05）（见表2）。

肺组织MPO活性、肺组织TNF-α含量的变化：

ALI组的肺组织MPO活性和TNF-α含量较C组显著增加（p<

LMWH100、200和300组的肺组织MPO活性与ALI组间的差异有统计学意义（p<

0.001）；

肺组织TNF-α水平也降低了，其中LMWH200组与ALI组间有统计学差异（p<

0.05）（见表3）。

ALI组肺组织ICAM-1和E-selectin的表达比C组明显增加（p<

LMWM各组降低了LPS致肺损伤后的TNF-α的表达（p<

0.05），LMWH各组的粘附分子表达与ALI组比较差异没有统计学意义。

ALI组TF和PAI-1的mRNA表达较盐水对照组显著升高（p<

LMWH预处理三组TF的mRNA表达较盐水对照组显著升高（p<

0.05），较ALI组差异无统计学意义（p>

LMWH200组和300组的PAI-1mRNA表达较ALI组明显降低（p<

0.05）（见表4）。

表2肺湿干重比、BALF总蛋白浓度、肺组织MPO活性和TNF-α含量的变化（n=10

s）

组别

肺组织湿干重比

BALF总蛋白浓度（μg/ml）

肺组织MPO

（U/g组织湿片）

肺组织TNF-α（pg/mg）

C组

4.86±

0.13

264.14±

120.99

51.53±

31.81

63.45±

28.59

ALI组

6.22±

1.09**

477.10±

101.08*

119.76±

64.60**

123.09±

64.27*

LMWH100组

5.77±

0.77

435.68±

207.98

66.05±

28.44##

81.17±

51.99

LMWH200组

5.17±

0.44#

475.93±

231.94*

57.31±

10.33##

74.98±

42.30#

LMWH300组

5.39±

0.63#

433.73±

259.32

61.37±

12.28##

80.90±

28.39

与C组相比，*p<

0.05，**p<

0.001

与ALI组相比，#p<

0.05，##p<

0.05

表3血浆PT、APTT和纤维蛋白原水平测定（n=9

PT（秒）

APTT（秒）

纤维蛋白原（g/L）

17.57±

1.74

15.66±

2.83

1.63±

0.06

21.96±

1.87**

25.50±

6.08*

1.07±

0.32**

21.86±

2.12**

26.47±

7.28**

1.29±

0.39*

19.79±

1.36*#

23.68±

4.42*

1.36±

0.19*#

21.76±

1.05**

29.50±

5.34**

1.08±

0.23**

与对照组比较，*P<

0.05，**P<

0.01；

与脂多糖组比较，#P<

0.05，##P<

表4肺组织炎性细胞因子和粘附分子mRNA的表达（x±

TF（倍数）

PAI-1（倍数）

1.00±

0.25

0.79

1.0000±

0.5479

0.4380

2.23±

0.90**

6.24±

5.95*

3.5627±

1.5021*

53.3462±

9.6905**

1.84±

0.36*

3.00±

1.22*

5.3554±

3.3624**

54.6440±

19.0033**

2.24±

0.63*

5.31±

5.48*

4.9104±

1.4071**

34.3493±

8.0510**#

1.75±

0.66*

3.15±

1.81*

4.0121±

1.6189*

36.6725±

10.3349**#

图1C组图2ALI组

图3LMWH100组图4LMWH200组

图5LMWH300组

讨论

低分子量肝素（lowmolecularweightheparin,LMWH）是近二十年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物，它是由普通肝素（unfractionatedheparin，UFH）经化学或酶解聚的方法得到的相对低分子质量的肝素片段或经分级法得到的低分子量肝素组分，分子量范围一般为3000~8000D，平均分子量为5000D左右。

LMWH有抗凝血、抗血栓、调血脂、抗肿瘤等作用。

与普通肝素相比，LMWH具有皮下注射吸收好，半衰期长，生物利用度高，与血浆、血小板亲和力小，出血副作用少等优点。

LMWH的主要药理作用为抗凝和抗血栓作用（1、2）。

肝素的抗凝作用一般认为主要通过两个方面：

（1）对凝血酶的抑制作用；

（2）对凝血活性因子Xa（FXa）的抑制作用。

LMWH的作用机制与肝素一样都是依赖于戊糖结构与抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）的结合，从而增强AT-Ⅲ对Xa因子和凝血酶的抑制作用。

其中肝素抑制凝血酶的作用不但要求肝素与AT-Ⅲ的结合，还同时要求肝素与凝血酶的直接结合。

这就需要肝素分子有足够的长度（至少18个单糖的长度，分子量至少为5400D），但肝素增强AT-Ⅲ抑制Xa因子的作用不需要肝素与Xa因子直接接触，此种作用对肝素无最低分子量上的要求。

LMWH由于片断较短，大部分分子长度均低于18个单糖的长度，因此抗Xa因子作用明显强于肝素。

研究表明普通肝素抗Xa因子与抗凝血酶的活性之比约为1，而LMWH抗Xa因子与抗凝血酶的活性之比介于2~4之间。

凝血酶的激活是血栓形成的主要因素之一，LMWH由于相对分子质量小有很强的抗Xa因子作用，能抑制凝血酶的激活，还能抑制血小板聚集，减少暂时性血小板凝块转变为永久性血小板纤维蛋白凝块的发生几率，能改变血液流变性，降低血液粘度，维持血液正常流动，因而抗血栓形成作用更加明显。

研究发现，LMWH还具有许多其他的作用，例如：

抑制肿瘤生长和转移的作用（3、4）、抑制肾小球系膜细胞及基质增生（5、6）以及调节血脂代谢、保护心肝肾组织细胞不受高胆固醇血症的损害（7）等作用。

此外，LMWH还具有抗炎作用。

近年来许多研究和实验观察到凝血与炎症存在相互作用的网络关系，一些天然抗凝物质具有抗炎作用。

最初发现抗凝