生化仪器分析复习资料101Word文件下载.docx

生化仪器分析复习资料101Word文件下载.docx

《生化仪器分析复习资料101Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化仪器分析复习资料101Word文件下载.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

增色效应：

吸收强度增强的效应

减色效应：

吸收强度减小的效应

4、饱和烃化合物、不饱和烃化合物紫外-可见吸收光谱的特点，蛋白质、核酸的紫外可见吸收光区

饱和烃及取代烃

饱和单键碳氢化合物含有C-H和C-C键，只含有σ键电子,一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区；

因为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，所以应用不多；

这类化合物在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等

不饱和烃及共轭烯烃

这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有π电子，吸收能量后可产生π－π*跃迁

由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（π－π*）带

特点：

强度大，摩尔吸收系数大，通常在104－2×

104Lmol-1cm-1，吸收峰的位置一般在217－280nm；

K吸收带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关

蛋白质紫外吸收光谱

构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区（<

220nm）均有光吸收。

在近紫外区（220-300nm）只有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有吸收光的能力。

苯丙氨酸的lmax＝257nm，酪氨酸的lmax＝275nm，色氨酸的lmax＝280nm

核酸紫外吸收

由于嘌呤碱和嘧啶碱紫外线吸收特性，所以核酸分子具有紫外吸收性质

一般在260nm左右有最大吸收峰（蛋白质在280nm），可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据

5、透光度和吸光度的关系，朗伯-比尔定律的公式，注意ε和a分别表示什么

透过光的强度（Ⅰt）和入射光强度（Ⅰo）之比称为透光度（T）：

T=Ⅰt/Ⅰo

•为表示物质吸收光的程度引入吸光度（A）概念：

朗伯-比尔定律的公式：

A=εbc=abc（波长一定）

当b以cm,c以g/L为单位时,吸光系数以a表示:

a=A/（bc）

当b以cm,c以mol/L为单位时,摩尔吸光系数以ε表示：

ε=A/（bc）

6、偏离朗伯-比尔定律的因素（单色光和溶液的浓度）

光学因素

（1）非单色光的影响：

Lamber-Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光。

一般仪器所获得的入射光是具有一定波长范围的复合光，由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，从而使得吸光度的变化偏离Lamber-Beer定律

消除方法：

选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定

（2）杂散光的影响：

杂散光：

指与测量波长相同，在仪器内部不通过试样而到达检测器的那部分辐射，以及单色器通带范围以外的额外辐射

杂散光来源：

仪器本身缺陷；

光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）

当杂散光可以被试样吸收，所得的吸光度大于真实值，出现正偏差；

若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差

消除办法：

提高仪器自身的性能

（3）反射光和散射光的影响：

反射光（吸收池内外界面间产生的）和散射光（颗粒较大的吸收质点产生的）均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响，产生假吸收的现象，使T↓，A↑，吸收光谱变形

※注：

一般可用空白对比校正消除

（4）非平行光的影响：

使光程↑，A↑，吸收光谱变形

化学因素

•Beer定律适用的另一个前提：

稀溶液；

浓度过高会使C与A关系偏离定律

•溶质浓度过高（>

0.01mol/L）,吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子的电荷分布相互影响，从而改变它对光的吸收能力，浓度越大，这种影响就越大

•溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化

※消除办法：

采用稀溶液分析

7、紫外可见吸收光谱仪的组成部件，光源的选择、单色器的作用、吸收池的选择

光源

基本要求：

发射强度足够且稳定的连续光谱;

光辐射强度随波长的变化小;

有足够的使用寿命

常用类型：

白炽光源与气体放电光源．

•白炽光源：

钨灯或卤钨灯－可见光源350～1000nm

•气体放电光源：

氢灯或氘灯－紫外光源200～600nm

单色器：

能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置

光栅

吸收池

1吸收池功能：

用于盛放分析试样

2材料

玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区

石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区

3要求：

匹配性（对光的吸收和反射应一致），为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向

检测器

功能：

检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置

信号指示系统

作用：

放大信号并以适当方式指示或记录下来

8、单光束分光光度计的特点、双光束分光光度计的特点、双波长分光光度计的特点

单光束分光光度计

（1）使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）→移动误差

（2）结构简单，操作方便，维修容易

（3）不能作全波段光谱扫描

双光束分光光度计

不用拉动吸收池，可以减小移动误差，简化测定程序;

可以自动扫描吸收光谱

双波长分光光度计

适用于分析多组分混合物，混浊试样（如生物组织液）。

测量时使用同一吸收池，不用空白作参比，消除了参比池的不同和制备空白溶液的影响

9、定性分析的方法，会根据woodward规则判断、比较不同化合物的波长大小（PPT第2章p65~p68）

（1）相同测定条件下，比较未知物和已知标准物的紫外光谱图

待测样品相同条件样品谱

标准物质标准谱

主要对比max，max及峰数目是否一致

max：

化合物特性参数，可作为定性依据；

max，max及峰数目都相同，可能是一个化合物；

（2）用经验公式计算max，与实验结果对照

10、紫外可见吸收光谱的定量分析过程（参考实验的步骤），注意分析条件的选择（选择λmax为入射光波长，样品浓度的选择）

（1）首先确定标准蛋白溶液的最大吸收波长，作测量波长

（2）标准曲线的制作：

用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在所选的测量波长上分别测定所配标准溶液的吸光度，记录所得读数。

以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（3）样品测定：

取待测溶液，按上述方法测定测量波长处的吸光度。

根据样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出待测蛋白质的浓度

分析条件的选择

选择适当的入射波长：

在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏；

一般应该选择λmax为入射光波长，但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长

（4）选择合适的参比溶液：

a.若待测组分简单，共存组分少，且在测波长处无吸收，用纯溶剂（水）作参比溶液。

b.若显示剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，采用不加样，同时加入试剂和溶液作参比溶液

（5）控制适宜的吸光度（读数范围）：

测量误差与吸光度读数有关，A=0.434，吸光度测定误差最小。

A选在0.15-1.00范围内，T在70%-100%，可以保证浓度测量的相对误差小于5%

11、红外吸收光谱和紫外-可见吸收光谱的异同点

相同点：

同为吸收光谱法；

都是由于分子中的能级跃迁产生的

不同点：

（1）光波长不同。

红外是指0.75～1000µ

m的电磁辐射；

紫外可见通常指200-750nm

（2）分子跃迁能级不同。

紫外也称电子光谱。

是由于分子中价电子跃迁所产生的；

红外光谱称为振转光谱，是振动和转动能级跃迁产生的

（3）研究对象和使用范围不同。

紫外光谱只能分析不饱和有机化学物。

特别是有共轭体系的化合物及少数无机物，所以紫外可见用于定性分析较少，多用于定量，红外适用于分析那些分子振动偶极矩变化不为0的化合物，除了少数分子外（单原子分子He、同核分子O2），几乎所有有机化合物都可用红外分析法研究应用范围广，多用于定性（红外的摩尔吸收系数低，定量效果不如紫外-可见）

（4）吸收光谱图不同

紫外可见吸收光谱：

横坐标：

波长（nm）纵坐标：

吸光度A

红外吸收光谱：

波数（cm－1）纵坐标：

透射比

12、红外光区分为哪三个区，常用的是哪个区，懂得波数和波长间的转换

红外光区的划分：

红外光谱在可见光区和微波光区之间，其波长范围约0.75～1000μm。

习惯上将红外光区划分为三个区域：

近红外、中红外（常用）、远红外。

绝大多数有机物和无机离子的化学键基频吸收都出现在中红外区。

通常说的红外光谱实指中红外光谱区

13、分子中基团的振动形式包括哪几种

伸缩震动、变形震动。

伸缩振动的k比变形振动k大；

因此伸缩振动出现在红外吸收光谱的高波数区，变形振动出现在红外吸收光谱的低波数区

14、线性分子、非线性分子振动自由度的计算

线形分子：

振动自由度=3N-5

非线形分子：

振动自由度=3N-6

15、红外光谱区分为哪两个区域，波数范围分别是

官能团区：

特征吸收峰是由分子伸缩振动产生的，能用于鉴定基团；

波数范围为4000～1300cm-1；

指纹区：

特征吸收峰是由单键的伸缩振动、变形振动产生的，能用于鉴定分子结构的细微区别，多用于对结构类似化合物的鉴定。

波数范围为1300～600cm-1。

16、官能团区和指纹区不同波数区域的吸收峰类型，尤其注意饱和碳氢，不饱和碳氢出现的区域，1600-1430cm-1苯环的特征区域，900-600cm-1判断芳烃取代基的类型

17、固体样品的制备方法

a溴化钾压片。

粉末样品常采用压片法，一般取试样2~3mg样品与200~300mg干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中混匀，充分研细至颗粒直径小于2μm，用不锈钢铲取70~90mg放入压片模具内，在压片机上用5~10×

107Pa压力压成透明薄片，即可用于测定。

b糊状法。

将干燥处理后的试样研细，与液体石蜡或全氟代烃混合，调成糊状，加在两KBr盐片中间进行测定。

液体石蜡自身的吸收带简单，但此法不能用来研究饱和烷烃的吸收情况。

c溶液法。

对于不宜研成细末的固体样品，如果能溶于溶剂，可制成溶液，按照液体样品测试的方法进行测试。

d薄膜法。

一些高聚物样品，一般难于研成细末，可制成薄膜直接进行红外光谱测定。

薄膜的制备方法有两种，一种是直接加热熔融样品然后涂制或压制成膜，另一种是先把样品溶解在低沸点的易挥发溶剂中，涂在盐片上，待溶剂挥发后成膜来测定。

18、色散红外吸收光谱仪的组成部件，光源

光源：

能斯特灯：

氧化锆、氧化钇和氧化钍烧结制成的中空或实心圆棒，直径1-3mm，长20-50mm；

室温下，非导体，使用前预热到800°

C；

发光强度大；

寿命0.5-1年；

硅碳棒：

两端粗，中间细；

直径5mm，长20-50mm；

不需预热；

两端需用水冷却；

多用光栅，只有色散型的红外光谱仪需要用单色器；

傅里叶变换红外光谱仪不需用到单色器

19、红外光谱图的解析

红外光谱图解析的一般步骤

（1）确定化合物的类型

（2）判断可能含有的官能团

（3根据吸收峰的位置推测基团所处的环境

（4）参考其他信息列出可能结构

（5）对照标准谱图或标准数据

20、荧光产生的机制，磷光产生的机制，荧光和磷光的区别

荧光发射：

当激发分子通过振动弛豫达到第一电子激发单重态的最低振动能级后，再以辐射形式发射光量子而返回至基态的各个振动能级，所发射的光量子即为荧光

磷光发射：

受激分子经激发单重态到三重态体系间跨越后，很快发生振动弛豫，到达激发三重态的最低振动能级，分子在三重态的寿命较长（10-4~10S），所以可延迟一段时间，然后以辐射跃迁返回基态的各个振动能级，所发射的光即为磷光

荧光和磷光的主要区别

•发光机制

–荧光是由单重态→基态的辐射跃迁产生的；

–而磷光是由单重态→三重态→基态的辐射跃迁产生的；

•发光延续时间

–对荧光来说，当激发光停止照射时，发光过程随之消失（10-9~10-7秒）；

–而磷光则将延续一段时间（10-4~10秒）

•能量大小

–磷光的能量比荧光小（因三重态的能量比单重态的低），波长较长，发光的时间也较长

21、辐射跃迁的种类，无辐射跃迁的种类（选择题）

辐射跃迁：

荧光、延迟荧光、磷光

无辐射跃迁：

系间窜跃、内转移、外转移、振动驰豫

22、荧光物质分子的两种特征光谱，各自的特点

激发光谱：

保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。

然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。

激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。

物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。

荧光光谱，又称发射光谱。

保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。

以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。

荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。

23、荧光分光光度计的组成部件，与紫外-可见分光光度计（紫外-可见吸收光谱）的区别，比如荧光分光光度计的入射光与检测器成垂直方向，而紫外-可见分光光度计的入射光和检测器是同方向？

测量荧光的仪器主要由五个部分组成：

激发光源、样品池、双单色器系统（分光系统）、检测器、记录仪。

特殊点：

有两个单色器或滤光片，光源与检测器通常成直角。

荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别

紫外-可见分光光度计

荧光分光光度计

光路

入射光与吸收光同方向

入射光与荧光垂直方向

两种光源（紫外+可见）

一种光源（紫外）

仪器校正

空白溶液（T=100%）

空白溶液（F=0）

紫外无吸收两面透光

低荧光材料四面透光

24、气相色谱按固定相的不同可分为？

两者的分离原理分别是？

按固定相状态的不同可分为

气-固色谱：

分离一些永久性的气体和低沸点的化合物

气-液色谱：

固定相的选择性大，应用广泛

气——固色谱中被分离物随着载气的流动，被测组分在吸附剂表面进行吸附，脱附，再吸附，再脱附……这样反复的过程不同物质在色谱柱中的保留时间不同而达到分离的目的。

气——液色谱中被分离物随着载气的流动，被测组分在固定液中进行溶解，挥发，再溶解，再挥发……的过程，使不同物质在色谱柱中的保留时间不同而达到分离的目的。

25、气相色谱仪的组成部件

载气系统、进样系统、

色谱柱系统：

关系到组分能否分开

检测系统：

关系到分离的组分能否鉴定出来

记录系统

26、保留时间、死时间、调整保留时间、保留体积、死体积、调整保留体积、相对保留值、分配系数

保留时间tR：

从进样开始到组分出现色谱峰顶点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间，色谱定性的参数

死时间to：

指不与固定相作用的惰性物质（如空气），从进样开始到出现色谱峰顶点所经过的时间。

to表示气体流经色谱柱空隙所需的时间，可以理解为某被测组分在流动相中的停留时间

调整保留时间tR’：

组分的保留时间与死时间之差值，即组分在固定相中滞留的时间。

保留体积VR：

从进样开始到组分出现色谱峰顶点时所消耗的流动相（载气）的体积

死体积Vo：

不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积，又指色谱柱中未被固定相所占据的空隙体积，即色谱柱的流动相体积（包括色谱仪中的管路、连接头的空间、以及进样器和检测器的空间）

调整保留体积VR’：

保留体积与死体积之差，即组分停留在固定相时所消耗流动相的体积

相对保留值r21：

调整保留值之比（注意意义）

r21表示固定相对两种组分的选择性。

r21越大，表明该色谱体系对这两组分的保留程度相差越大，即选择性越好，被分离组分越容易达到良好的分离，所以r21又称为选择性因子。

由于r21只与柱温、固定相性质有关，而与柱长、柱内径、载气流速及填充情况等无关。

所以，采用注明温度和固定相的r21作为定性指标，不受操作条件变化的影响

分配系数：

在一定温度下，组分在两相之间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K表示。

特定组分的K值是一常数；

K值大小表明组分与固定相分子间作用力的大小

27、担体是用于承载固定液的，和固定液一起构成气液色谱的固定相，担体的分类，适用的范围（了解，选择题）

分类：

（1）硅藻土类：

具有一定粒度的多孔性固体微粒

红色：

涂非极性（弱极性）固定液，分离非极性、弱极性物质

白色：

涂极性固定液，分离极性或碱性物质

（2）非硅藻土类（应用范围较小）

玻璃微球（分析高沸点和易分解物质），石英微球，氟塑载体（分析腐蚀性气体），含氟化合物

28、固定液的分类、固定液的选择原则，不同物质在不同固定液中的出峰顺序

固定液分类：

按极性分类，可分为非极性、中等极性、强极性和氢键型四种类型

按相似相溶原则选择

1）分离非极性物质选用非极性固定液。

组分按沸点从低到高的顺序出峰。

2）分离极性物质选用极性固定液。

组分按极性从小到大的顺序出峰。

3）分离非极性和极性混合物时选用极性固定液。

非极性组分先出峰，极性组分后出峰。

4）氢键型试样选用氢键型固定液，组分按与固定液分子间形成氢键能力的大小出峰。

5）复杂组分可选用两种或两种以上固定液。

6）样品极性未知，要先用常用的几种固定液做预实验确定样品的极性

29、气相色谱定量分析的计算，三种常用的定量方法（归一化法、内标法、外标法）

归一化法

前提：

试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰

依据：

组分含量与峰面积成正比

优点：

•简便，准确

•定量结果与进样量、重复性无关

•色谱条件略有变化对结果几乎无影响

缺点：

•所有组分必须在一定时间内都出峰

•必须已知所有组分的校正因子

•不适用于微量杂质的测定

内标法

以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出某组分的含量

对内标物要求：

a．内标物须为原样品中不含组分

b．内标物与待测物保留时间应接近且r>

1.5

c．内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质

内标法优点：

•重复性及操作条件对结果无影响

•只需待测组分和内标物出峰，其他组分可无峰

内标法缺点：

制样要求高；

找合适内标物困难

外标法

以待测组分纯品为对照物，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，求出标准曲线，而后计算样品的含量

外标法特点：

1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰

2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大→每次进样量应一致，否则产生误差

30、高效液相色谱与气相色谱的区别

相同：

兼具分离和分析功能，均可以在线检测

（1）主要差别：

分析对象的差别和流动相的差别

GC：

能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%

HPLC：

溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制。

分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%

（2）流动相差别

GC：

流动相为惰性气体

组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

输送流动相压力仅为0.1~0.5MPa

HPLC：

流动相为液体

流动相可为离子型、极性、非极性、弱极性溶液，可与被分析样品产生相互作用，能改善分离的选择性

输送流动相压力高达2~20MPa

（3）操作条件差别

加温操作，柱温为常温至300°

C

柱温为常温。

31、液固吸附色谱的分离原理，液液分配色谱的分离原理，正相色谱、反相色谱，正相的出峰顺序、反相的出峰顺序

液-固吸附色谱

基本原理：

根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的

液液分配色谱法

分离机制：

利用组分在两相中溶解度的差异

正相色谱——固定液极性>

流动相极性（NLLC）适于分离极性较强的水溶性样品

反相色谱——固定液极性<

流动相极性（RLLC）适于分离油溶性组分

正相的出峰顺序：

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分；

反相出峰顺序：

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱；

适于分离非极性组分。

32、高效液相色谱仪的结构组成，梯度洗脱装置的作用

主要部件：

输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统。

梯度洗脱装置：

多组分复杂样品分离时，前面一些组分分离不完全，后面一些组分分离度太大，且出峰很晚或峰型较差。

为使保留值相差很大的多种组分在合理的时间内全部洗脱并达到分离，要用到梯度洗脱技术。

33、高效液相色谱仪检测器可分为溶质性质检测器和整体性质检测器，紫外检测器和荧光检测器各属于哪一种？

a）溶质性质检测器：

对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）

b）整体性质检测器:

不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）

34、紫外检测器的特点、检测局限（流动相的截止波长必须小于检测波长）

利用光电二极管矩阵可获得三维光谱-色谱图。

紫外检测器

灵敏度较高（10-6—10-9g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）

局限：

只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波