植物材料的培养及组培及农杆菌侵染Word文档格式.docx

植物材料的培养及组培及农杆菌侵染Word文档格式.docx

《植物材料的培养及组培及农杆菌侵染Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物材料的培养及组培及农杆菌侵染Word文档格式.docx（16页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

1．划平板活化菌种，挑单菌落37℃摇小管2ml过夜，1：

100放大（0.5ml菌→50ml菌），待OD600=0.3-0.4，将装菌的瓶子置于冰上10-30min。

同时冰上预冷0.1MCaCl2，冷冻离心机4℃预冷。

2．3000rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。

3．用10mlCaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。

置于冰上30分钟。

4．2500rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。

5．用2mlCaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。

每管200μl，管子需预冷

6．置于冰上2hr-48hr内使用

热击

冰上30min，42℃90sec，并上10min。

加入200μlLB37℃复苏2hr。

农杆菌感受态细胞的制备（电击）

1）接种小养（eg.3ML）28℃培养过夜。

2）1:

100放大培养（eg。

300MLYEB中）至OD=0.5。

3）icechilled 

5000rpm10min（冷冻离心机,预冷到4℃）。

4）Washedby1mMHEPES（PH7.0）3次（每次10ML）。

5）10%甘油洗一次。

6）溶于3ML10%甘油中,40ｕL每管于-70℃保存。

备注:

离心管,dorf管,HEPES,甘油均须冰上预冷,所有的操作以在冰上进行为好.

另：

农杆菌电击感受态细胞还可按大肠杆菌电击感受态细胞同样的制作。

农杆菌电击转化实验

1）调节电击仪,使其电脉冲为25ｕF,电压为2.5KV,电阻为400Ω。

2）从-70℃冰箱中取出电击感受态细胞（EHA105）,置于冰上使其融化。

3）加1ｕL质粒于感受态细胞中，轻轻混匀。

4）将上述菌液和DNA悬液加进电击杯的底部，迅速将电击杯放进电击仪。

5）按设定的参数,启动对细胞的电脉冲。

6）电击以后，尽快取出样品，加入1ML无抗YEB培养基。

7）将上述菌液转入1.5MLdorf管中，28℃2小时以上。

8）将菌液涂布在加有相应抗生素的YEB培养基上，28℃培养2-3天，直至菌落长出。

所有操作最好在冰上进行；

电击杯电击之前在冰上预冷；

电击杯中要除去气泡。

农杆菌感受态细胞的制备（热击）

1）从YEB和YEP培养基平板上分别挑取单菌落，接种于含有3ml液体培养基的试管中，28℃振荡培养16~18h。

2）从试管中取出200μl菌液接种于含20ml相应液体培养基中（100倍稀释），培养4~6h至对数生长期。

取1.5ml菌液加入到1.5ml的无菌离心管中，4℃，3000rpm离心5min，弃上清。

沉淀用800μl的预冷TE溶液（10mMTris-HClpH7.5；

1mMEDTApH7.5）洗一次，4℃，3000rpm离心5min，弃上清。

3）沉淀用800μl的YEB（YEP）培养基重新悬浮，然后按每管200μl分装到1.5ml的无菌离心管中，液氮速冻后于-70℃保存备用。

农杆菌热击转化实验

1）转化前将保存的感受态细胞在冰上融化。

2）加入0.5~1μg质粒DNA，同时以无菌水代替DNA作为对照，冰上放置5min。

3）液氮中速冻5min。

4）取出后立即于37℃保温5min。

5）每管中加入800μlYEB液体培养基，28℃恒温摇床缓慢振荡2~4h。

6）取200μl菌液涂于YEB（含有Sm和Km）或YEP（含有Cm和Km）的固体筛选培养基上，于28℃恒温培养箱中培养，两天后观察菌落的生长情况。

#TE也可以用100mmolCaCl2代替！

！

外源片段和质粒载体的连接反应

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'

磷酸和相邻的3'

羟基之间形成的新的共价链。

如质粒载体的两条链都带5'

磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。

但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。

在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

相邻的5'

磷酸和3'

羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。

实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。

这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含：

1）足量的载体DNA，以满足j:

i>

1和j:

i<

3。

对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。

2）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。

这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。

如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

粘端连接

1）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。

如有必要，可用凝胶电泳分离片段并用碱性磷酸酶处理质粒DNA。

通过酚：

氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE（pH7.6）溶液使其浓度为100/ml。

2）按如下所述设立连接反应混合物：

a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNA。

b．加水至7.5μl，于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到0℃。

c．加入10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液1μl，T4噬菌体DNA连接酶0.1Weiss单位，5mmol/LATP1μl，于16℃温育1～4小时

3）每个样品各取1～2μl转化大肠杆菌感受态细胞。

平端DNA连接

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接，由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。

有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。

然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：

1）低浓度（0.5mmol/L）的ATP（Ferretti和Sgaranekka,1981）。

2）不存在亚精胺一类的多胺。

3）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

4）高浓度的平端。

在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇或氯化六氨全高钴,可以使如何取得适当浓度的平端的DNA总是迎刃而解。

在连接反应中，这些物质具有两作用：

1）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大1～3个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。

2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。

这样，即使在有利于自身环化（j:

i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。

拟南芥和水稻材料培养及转化

拟南芥植物材料的培养

（1）人工土：

3份蛭石，1份珍珠岩和2份黑土混合

（2）PNS营养液：

每升含5ml1MKNO3，2ml1MCa（NO3）2˙4H2O，2ml1MMgSO4˙7H2O，

2.5ml20mMFe.EDTA，2.5ml1M磷酸缓冲液（pH5.5），1mlMS微量元素。

（3）PNS营养液母液配方：

①1MKNO3101.1g

②1MCa（NO3）2˙4H2O236.15g

③1MMgSO4˙7H2O，246.48g

④20mMFe.EDTA：

FeSO45.57g，EDTA7.45g。

注意先各自配成溶液，再混合。

⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：

磷酸二氢钾130.4g，磷酸氢二钾9.12g

⑥MS微量元素：

硼酸0.434g

硫酸锰（MnSO4H2O）1.7626g

CuSO4˙H2O0.0798g

ZnSO4˙7H2O0.172g

NaMoO4˙2H2O0.0432g

NaCl0.585g

CoCl˙6H2O0.00129g

以上母液均配至1L

1）当年收获的种子种植后4度春化72h，隔年种子种植后春化24h。

然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗﹑16h光照培养。

2）将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。

3）将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上，一盆不宜超出十棵。

用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。

22度左右，可24小时光照。

4）土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。

若要做转化，待抽薹2到3公分时，剪除顶花絮，用营养液再浇灌一次。

5）种子的收集：

拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干爆后将拟南芥剪下，放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。

拟南芥的转化和转化子的筛选

渗透培养基（1L）：

1/2xMurashige-Skoog；

5%蔗糖；

0.5克MES；

用KOH调至pH5.7；

再加：

10微升1mg/ml的6-BA母液；

200微升SilwetL-77）

1）制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液OD600当在1.2到1.6之间。

室温5000rpm离心10分钟。

弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD600在0.8左右。

2）先将植株上已长出的果荚及开开的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。

盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。

3）一周后再喷洒一次。

收种子，在相应的抗性平板上筛选转化子。

4）转化子的筛选：

种子消毒，先用70%乙醇浸泡10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。

最后用无菌水洗四次。

5）处理后的种子用Topagar（0.1%琼脂水溶液）均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面。

一块150mm直径的平皿最多种1500棵。

6）4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。

若已确定为转化子，即可移栽浇过饱和PNS营养液的人工土壤生长。

注意事项

6-BA母液配制时用乙醇溶解。

1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制，但大量元素减半。

水稻转化

（1）材料的预处理

幼胚的处理步骤如下：

（a）采集受粉后12-15天未成熟的种子，在这个时期的胚乳相对固化，但仍成乳状。

（b）人工去除稃毛和稃壳。

（c）将去壳种子在70%－75%乙醇中浸泡1分钟，倒去废液。

（d）将去壳种子在33%次氯酸钠中（加一滴吐温80）灭菌2小时，倒去废液。

（e）无菌水洗10次，无菌纱布吸干水分。

（f）在无菌条件下用手术刀和镊子解剖幼胚。

（g）将幼胚直接转入NBD2（2,4D浓度2mg/L）培养基平板中。

（h）26℃暗培养4-5天。

成熟胚的处理步骤如下：

（a）将干种子去壳。

（b）将去壳种子在70%－75%乙醇中浸泡1分钟。

（c）将去壳种子在33%次氯酸钠中（加一滴吐温80）灭菌15分钟，倒去废液。

（d）用1‰砷汞灭菌15分钟,倒去废液。

（f）将整个种子转移至NBD2（2,4D浓度2mg/L）培养基平板，26℃暗培养8-10天。

（g）当黄色愈伤组织在胚轴出现时，切除根部和胚乳，将胚轴转移至一个新鲜的NBD2培养基，培养10天后转化。

（2）挑取EHA105农杆菌单菌落，在100ml加卡那霉素的YEB培养基中震荡培养约16小时（200rpm，28℃），至OD600为0.6-0.8。

（3）3000rpm离心10分钟，在AAM-AS（AS浓度200μM/L）液体培养基中重悬沉淀至浓度OD600为0.6-0.8。

（4）将300个带有黄色愈伤的胚浸泡在细菌悬液中20分钟，间或震荡。

（5）从悬液中收集胚，在两张无菌吸水纸上吸干。

（6）在NBD2-AS（AS浓度为100μM/L）培养基平板表面放上2张无菌滤纸，把胚放在滤纸表面，26℃暗培养3天。

（7）把胚的根部去掉，把胚放入NBD2培养基平板上，培养基中事先加入潮霉素40mg/L，头孢400mg/L，羧卞200mg/L,26℃暗培养12天。

（8）再转入新鲜的NBD2培养基平板上,培养基中事先加入潮霉素40mg/L，头孢400mg/L，26℃暗培养12天。

在这个时间可以看见新的愈伤长出。

（9）把抗性愈伤（将抗性愈伤从胚上切下）放在预分化培养基（Pre-MS）平板上，26℃暗培养6-8天。

（10）把愈伤放在分化培养基MS-H培养基平板上，加潮霉素25mg/L，26℃（24小时光照）培养，当绿芽出现（大约15天），立即将它们转入新鲜的MS-H培养基平板上，加潮霉素25mg/L，新的无根苗在10天内形成。

（11）将无根苗移入再生培养基MSNH上，诱导根的形成。

（12）当根形成后，把苗移入温室。

培养基配方：

（1）MS母液：

母液1：

20×

大量元素（500ml）

KNO338g

NH4NO333g

MgSO4·

7H2O7.4g

母液2：

钙盐（1L）

CaCl2·

2H2O8.8g

母液3：

钾盐（1Ll）

KH2PO43.4g

母液4：

100×

微量元素（1L）

MnSO4·

4H2O2230mg

ZnSO4·

7H2O860mg

H3BO3620mg

KI83mg

Na2MoO4·

2H2O25mg

CuSO4·

5H2O2.5mg

CoCl2·

6H2O2.5mg

母液5：

维生素（500ml）

甘氨酸200mg

盐酸硫胺素40mg

盐酸吡哆素50mg

烟酸50mg

肌醇10000mg

母液6：

200×

铁盐（500ml）

Na2-EDTA3730mg

FeSO4·

7H2O2780mg

配制1LMS培养基时分别加入母液1、2、3各50ml，母液410ml，母液5、6各5ml。

（2）AAM-AS液体培养基

10×

AA大量元素

KH2PO41.7g/L

7H2O3.7g/L

2H2O4.4g/L

AA微量元素I

H2O1.69g/L

7H2O0.86g/L

H3BO30.62g/L

KI0.083g/L

1000×

AA微量元素II

5H2O0.025g/L

NaMoO4·

2H2O0.25g/L

6H2O0.025g/L

AA氨基酸

谷氨酰胺8.77g/L

天冬氨酸2.66g/L

精氨酸2.88g/L

甘氨酸0.75g/L

MS维生素

烟酸0.05g/L

盐酸硫胺素0.1/L

盐酸吡哆醇0.05g/L

配制1LAAM培养基加入AA大量100ml，AA微量I10ml，AA微量II1ml，AA氨基酸100ml，铁盐5ml，MS维生素10ml。

另外加入：

KCL2.94/L

水解酪蛋白500mg/L

蔗糖68.5g/L

葡萄糖36g/L

肌醇0.1g/L

调节pH值至5.2，高压灭菌。

用时加入AS（乙酰丁香酮）200Μμ/L。

（3）Pre-MS预分化培养基

MS母液6瓶，外加

干酪素800mg/L

6-BA2mg/L

激动素（KT）0.5mg/L

NAA1mg/L

蔗糖30g/L

调节PH值至5.8，高压灭菌。

使用前加ABA5mg/L。

（4）MS-H分化培养基

干酪素500mg/L

NAA0.5mg/L

山梨醇15g/L

（5）NBD2（2,4D浓度2mg/L）培养基

N6大量母液1：

大量元素（1L）

KNO356.6g

（NH4）2SO49.26g

KH2PO48g

N6大量母液2：

40×

2H2O3.32g

N6大量母液3：

MgSO4∙7H2O3.7g

B5微量元素I：

溶液A：

MnSO4∙H2O781mg

ZnSO4∙7H2O200mg

溶于400ml无菌水

溶液B：

H3BO3300mg

KI75mg

然后缓慢将溶液A和溶液B混合，定容至1L

B5微量元素II：

微量元素（500ml）

2H2O125mg

5H2O12.5mg

6H2O12.5mg

B5维生素I：

盐酸硫胺素500mg

盐酸吡哆醇50mg

B5维生素II：

甘氨酸100mg

2,4D：

2,4D

200mg2,4D，先溶于1ml无水乙醇中，再定容到1L。

配制1LNBD2培养基时分别加入母液150ml，母液2、3各25ml，B5微量I10ml，B5微量II1ml，B5维生素I、II各10ml和200×

铁盐5ml，另加入

蔗糖30g

肌醇0.1g

L-脯氨酸0.5g

L-谷氨酰胺0.5g

水解酪蛋白0.5g

调节pH值至5.8，高压灭菌。

（固体培养基加0.7%的琼脂粉）

（6）NBD2-AS培养基

配制1LNB-AS培养基时按照NB-2,4D培养基配方加入9个母液，另外再加入

水解酪蛋白1g

葡萄糖10g

调节pH值至5.2，高压灭菌（固体培养基加0.2%的phytagel）。

倒平板时加入AS（乙酰丁香酮）100μΜ/L。

（7）MSNH再生培养基

干酪素250mg/L

IBA0.5mg/L

潮霉素50mg/L

头孢200mg/L

phytagel2g/L

抗生素临用前再加。