植物材料的培养及组培及农杆菌侵染Word文档格式.docx

1、1 划平板活化菌种，挑单菌落37摇小管2ml过夜，1：100放大（0.5ml 菌50ml 菌），待OD600=0.3-0.4，将装菌的瓶子置于冰上10-30min。同时冰上预冷0.1M CaCl2，冷冻离心机4预冷。2 3000rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。3 用10ml CaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。置于冰上30分钟。4 2500rpm离心10分钟，迅速弃尽上清。5 用2ml CaCl2轻柔的于冰上将菌摇散。每管200l ，管子需预冷6 置于冰上2hr-48hr内使用热击冰上30min，42 90sec，并上10min。加入200 l LB 37复苏2hr。农杆菌感受态细胞的制备（电击

2、）1）接种小养（eg.3ML）28培养过夜。2）1:100放大培养（eg。300ML YEB中）至OD=0.5。3）ice chilled 5000rpm 10min （冷冻离心机,预冷到4）。4）Washed by 1mM HEPES （PH7.0） 3次（每次10ML）。5）10%甘油洗一次。6）溶于3ML 10%甘油中,40L 每管于 -70保存。备注:离心管,dorf管,HEPES,甘油均须冰上预冷,所有的操作以在冰上进行为好.另：农杆菌电击感受态细胞还可按大肠杆菌电击感受态细胞同样的制作。农杆菌电击转化实验1）调节电击仪,使其电脉冲为25F,电压为2.5KV,电阻为400。2）从-7

3、0冰箱中取出电击感受态细胞（EHA105）,置于冰上使其融化。3）加1L质粒于感受态细胞中，轻轻混匀。4）将上述菌液和DNA悬液加进电击杯的底部，迅速将电击杯放进电击仪。5）按设定的参数,启动对细胞的电脉冲。6）电击以后，尽快取出样品，加入1ML无抗YEB培养基。7）将上述菌液转入1.5MLdorf管中，28 2小时以上。8）将菌液涂布在加有相应抗生素的YEB培养基上， 28培养2-3天，直至菌落长出。所有操作最好在冰上进行；电击杯电击之前在冰上预冷；电击杯中要除去气泡。农杆菌感受态细胞的制备（热击）1） 从YEB和YEP培养基平板上分别挑取单菌落，接种于含有3ml 液体培养基的试管中，28振

4、荡培养1618h。2） 从试管中取出200l菌液接种于含20ml 相应液体培养基中（100倍稀释），培养46 h至对数生长期。取1.5ml菌液加入到1.5ml 的无菌离心管中，4，3000rpm离心5min，弃上清。沉淀用800l的预冷TE溶液（10mM Tris-HCl pH7.5；1mM EDTA pH7.5）洗一次，4，3000rpm离心5min，弃上清。3） 沉淀用800l的YEB（YEP）培养基重新悬浮，然后按每管200l分装到1.5ml 的无菌离心管中，液氮速冻后于-70保存备用。农杆菌热击转化实验1） 转化前将保存的感受态细胞在冰上融化。2） 加入0.51g质粒DNA，同时以无菌

5、水代替DNA作为对照，冰上放置5min。3） 液氮中速冻5min。4） 取出后立即于37保温5min。5） 每管中加入800l YEB液体培养基，28恒温摇床缓慢振荡24h。6） 取200l菌液涂于YEB（含有Sm和Km）或YEP（含有Cm和Km）的固体筛选培养基上，于28恒温培养箱中培养，两天后观察菌落的生长情况。#TE也可以用100mmolCaCl2代替！外源片段和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA 5磷酸和相邻的3羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链

6、。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含：1）足量的载体DNA，以满足j:i1和j:i3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60g/ml。2）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体

7、低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。粘端连接1）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE （pH7.6） 溶液使其浓度为100/ml。2）按如下所述设立连接反应混合物：a将0.1 l载体转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNA。b加水至7.5 l，于45加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到0。c加入1

8、0 x T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1 l，T4噬菌体DNA连接酶 0.1Weiss单位，5 mmol/L ATP 1 l，于16温育14小时3）每个样品各取12 l转化大肠杆菌感受态细胞。平端DNA连接T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接，由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：1）低浓度（0.5mmol/L）的ATP（Ferretti和Sgaranekka,1981）。2）不存在亚精胺一类的多胺。3）极高浓度的连接酶（50Wei

9、ss单位ml）。4）高浓度的平端。在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇或氯化六氨全高钴,可以使如何取得适当浓度的平端的DNA总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：1）它们可使平端的连接速率加大13个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。拟南芥和水稻材料培养及转化拟南芥植物材料的培养（1） 人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和2份黑土混合（2

10、） PNS营养液：每升含5ml 1M KNO3，2ml 1M Ca（NO3）24H2O，2ml 1M MgSO47H2O，2.5ml 20mM Fe.EDTA，2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），1ml MS 微量元素 。（3） PNS营养液母液配方： 1M KNO3 101.1g 1M Ca（NO3）24H2O 236.15 g 1M MgSO47H2O，246.48 g 20mM Fe.EDTA：FeSO4 5.57g，EDTA 7.45g。注意先各自配成溶液，再混合。 1M磷酸缓冲液（pH5.5）：磷酸二氢钾 130.4g，磷酸氢二钾 9.12g MS 微量元素：硼酸 0.434g

11、 硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626gCuSO4H2O 0.0798g ZnSO47H2O 0.172g NaMoO42H2O 0.0432g NaCl 0.585g CoCl6H2O 0.00129g 以上母液均配至1 L1）当年收获的种子种植后4度春化72 h，隔年种子种植后春化24 h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h黑暗16 h光照培养。2）将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。3）将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上，一盆不宜超出十棵。用保

12、鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。22度左右，可24小时光照。4）土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3公分时，剪除顶花絮，用营养液再浇灌一次。5）种子的收集：拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干爆后将拟南芥剪下，放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。拟南芥的转化和转化子的筛选渗透培养基（1 L）：1/2xMurashige-Skoog；5% 蔗糖；0.5克 MES；用KOH调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA 母液；200微升Silwet L-77）1）制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转

13、入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液OD600当在1.2到1.6之间。室温5000rpm离心10分钟。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD600在0.8左右。2）先将植株上已长出的果荚及开开的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。3）一周后再喷洒一次。收种子，在相应的抗性平板上筛选转化子。4）转化子的筛选：种子消毒，先用70%乙醇浸泡10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。5）处理后的种子用Top agar（0.1%琼脂水溶液）

14、均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。6）4春化2到3天，移入22恒温室培养。若已确定为转化子，即可移栽浇过饱和PNS营养液的人工土壤生长。注意事项6-BA 母液配制时用乙醇溶解。1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制，但大量元素减半。水稻转化（1） 材料的预处理幼胚的处理步骤如下：（a） 采集受粉后 12-15天未成熟的种子，在这个时期的胚乳相对固化，但仍成乳状。（b） 人工去除稃毛和稃壳。（c） 将去壳种子在 70%75%乙醇中浸泡 1分钟，倒去废液。（d） 将去壳种子在 33%次氯酸钠中（加一滴吐温80）灭菌 2小时，倒去

15、废液。（e） 无菌水洗 10次，无菌纱布吸干水分。（f） 在无菌条件下用手术刀和镊子解剖幼胚。（g） 将幼胚直接转入 NBD2（2,4D浓度2mg/L）培养基平板中。（h） 26暗培养 4-5天。成熟胚的处理步骤如下：（a） 将干种子去壳。（b） 将去壳种子在 70%75%乙醇中浸泡1 分钟。（c） 将去壳种子在 33%次氯酸钠中（加一滴吐温80）灭菌 15分钟，倒去废液。（d） 用 1砷汞灭菌 15分钟, 倒去废液。（f） 将整个种子转移至 NBD2（2,4D浓度2mg/L）培养基平板，26暗培养 8-10天。（g） 当黄色愈伤组织在胚轴出现时，切除根部和胚乳，将胚轴转移至一个新鲜的 NBD

16、2培养基，培养 10天后转化。（2） 挑取 EHA105农杆菌单菌落，在 100ml加卡那霉素的 YEB培养基中震荡培养约 16小时（200rpm，28），至OD600 为0.6-0.8。（3） 3000rpm 离心 10分钟，在 AAM-AS（AS浓度200M/L）液体培养基中重悬沉淀至浓度OD600 为 0.6-0.8。（4） 将 300个带有黄色愈伤的胚浸泡在细菌悬液中 20分钟，间或震荡。（5） 从悬液中收集胚，在两张无菌吸水纸上吸干。（6） 在 NBD2-AS（AS浓度为100M/L）培养基平板表面放上2张无菌滤纸，把胚放在滤纸表面，26暗培养 3天。（7） 把胚的根部去掉，把胚放入

17、 NBD2培养基平板上，培养基中事先加入潮霉素 40mg/L，头孢 400mg/L，羧卞 200mg/L, 26暗培养 12天。（8） 再转入新鲜的 NBD2培养基平板上, 培养基中事先加入潮霉素 40mg/L，头孢 400mg/L，26暗培养 12天。在这个时间可以看见新的愈伤长出。（9） 把抗性愈伤（将抗性愈伤从胚上切下）放在预分化培养基（Pre-MS）平板上，26暗培养6-8 天。（10） 把愈伤放在分化培养基 MS-H培养基平板上，加潮霉素 25mg/L，26（24 小时光照）培养，当绿芽出现（大约15 天），立即将它们转入新鲜的 MS-H培养基平板上，加潮霉素 25mg/L，新的无根

18、苗在 10天内形成。（11）将无根苗移入再生培养基 MSNH上，诱导根的形成。（12）当根形成后，把苗移入温室。培养基配方：（1） MS 母液：母液1：20大量元素（500ml）KNO3 38gNH4NO3 33gMgSO47H2O 7.4g母液2：钙盐（1L）CaCl22H2O 8.8g母液3：钾盐（1Ll）KH2PO4 3.4g母液4：100微量元素（1L）MnSO44H2O 2230mgZnSO47H2O 860mgH3BO3 620mgKI 83mgNa2MoO42H2O 25mgCuSO45H2O 2.5mgCoCl26H2O 2.5mg母液5：维生素（500ml）甘氨酸 200mg

19、盐酸硫胺素 40mg盐酸吡哆素 50mg烟酸 50mg肌醇 10000mg母液6：200铁盐（500ml）Na2-EDTA 3730mgFeSO47H2O 2780mg配制1L MS 培养基时分别加入母液1、2、3 各 50 ml，母液4 10 ml，母液5、6各 5ml。（2） AAM-AS 液体培养基10AA大量元素KH2PO4 1.7g/L7H2O 3.7g/L2H2O 4.4g/LAA微量元素I H2O 1.69g/L7H2O 0.86g/LH3BO3 0.62g/LKI 0.083g/L1000AA微量元素II5H2O 0.025g/LNaMoO42H2O 0.25g/L6H2O 0

20、.025g/LAA氨基酸 谷氨酰胺 8.77g/L天冬氨酸 2.66g/L精氨酸 2.88g/L甘氨酸 0.75g/LMS维生素 烟酸 0.05g/L盐酸硫胺素 0.1/L盐酸吡哆醇 0.05g/L配制1L AAM培养基加入AA大量 100ml，AA微量I 10ml，AA微量II 1ml，AA氨基酸 100ml，铁盐 5ml，MS维生素 10ml。另外加入：KCL 2.94/L水解酪蛋白 500mg/L蔗糖 68.5g/L葡萄糖 36g/L肌醇 0.1g/L调节pH 值至5.2，高压灭菌。用时加入 AS（乙酰丁香酮）200/L。（3） Pre-MS预分化培养基MS母液6瓶，外加干酪素 800

21、mg/L6-BA 2 mg/L激动素（KT） 0.5mg/LNAA 1mg/L蔗糖 30g/L调节PH 值至5.8，高压灭菌。使用前加ABA 5mg/L。（4） MS-H分化培养基干酪素 500 mg/LNAA 0.5 mg/L山梨醇 15 g/L（5） NBD2（2,4D浓度2mg/L） 培养基N6大量母液1：大量元素（1L）KNO3 56.6g（NH4）2SO4 9.26gKH2PO4 8gN6大量母液2：402H2O 3.32gN6大量母液3：MgSO47H2O 3.7gB5微量元素I：溶液A：MnSO4H2O 781mgZnSO47H2O 200mg溶于400ml无菌水溶液B：H3BO

22、3 300mgKI 75mg然后缓慢将溶液A和溶液B混合，定容至1LB5微量元素II：微量元素（500ml）2H2O 125mg5H2O 12.5mg6H2O 12.5mgB5维生素I：盐酸硫胺素 500mg盐酸吡哆醇 50mgB5维生素II：甘氨酸 100mg2,4 D：2,4 D200mg 2,4 D，先溶于1ml 无水乙醇中，再定容到1L。配制1L NBD2 培养基时分别加入母液1 50 ml，母液2、3 各25 ml，B5微量I 10 ml，B5微量II 1ml，B5维生素I、II 各10ml 和200铁盐 5 ml，另加入蔗糖 30g肌醇 0.1gL-脯氨酸 0.5gL-谷氨酰胺 0.5g水解酪蛋白 0.5g调节pH 值至5.8，高压灭菌。（固体培养基加0.7%的琼脂粉）（6） NBD2-AS 培养基配制1L NB-AS 培养基时按照NB-2,4D培养基配方加入9个母液，另外再加入水解酪蛋白 1g葡萄糖 10g调节pH 值至5.2，高压灭菌（固体培养基加0.2%的phytagel）。倒平板时加入 AS（乙酰丁香酮）100/L。（7） MSNH再生培养基干酪素 250 mg/LIBA 0.5mg/L潮霉素 50mg/L头孢 200 mg/Lphytagel 2g/L抗生素临用前再加。