自噬Word文档格式.docx
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由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？
）。
自噬相关基因（autophagyassociatedgene,ATG）：
在自噬过程中到底有哪些蛋白的参与，即自噬相关蛋白的鉴定是目前自噬研究主要的任务。
由于自噬研究的历史关系，很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。
在http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
rid=eurekah.table.24964中介绍了一些较早发现的自噬相关基因，下面列出几个新近发现的：
1）bif-1（又叫EndophilinB1）和UVRAG（ultravioletirradiationresistance-associatedgene）
相关文章：
Bif-1interactswithBeclin1throughUVRAGandregulatesautophagyandtumorigenesis.pdf
2）VMP1（Vacuolemembraneprotein1）
ThePancreatitis-inducedVacuoleMembraneProtein1TriggersAutophagyinMammalianCells.pdf
3）DRAM（damage-regulatedautophagymodulator）
DRAM,ap53-InducedModulatorofAutophagy,IsCriticalforApoptosis.pdf
4）TP53INP2（TumourProtein53InducedNuclearProtein2）
TheTP53INP2ProteinIsRequiredforAutophagyinMammalianCells.pdf
自噬过程的调控：
从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。
这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。
目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。
关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有：
抑制类
1）ClassIPI3Kpathway（PI——phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）
与IRS（Insulinreceptorsubstrate）结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）
详细介绍参见：
维基百科http:
//en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_3-kinase
2）mTORpathway（mammaliantargetofrapamycin）
mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506bindingprotein12-rapamycinassociatedprotein1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。
能接受多种上游信号，如ClassIPI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化。
详细介绍见：
http:
//en.wikipedia.org/wiki/MTOR
激活类
1）ClassIIIPI3K
结构上类似于ClassIPI3K，但作用相反。
接受上述信号的自噬蛋白：
目前都把焦点集中在beclin1（酵母同源物为atg6），能与多种蛋白结合，如Vps34（ClassIIIPI3K的催化亚单位），mTOR，BCL-2和BCLXL蛋白等，更多介绍请参阅OMIM：
//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?
id=604378。
在【动态版】
需注意的是，beclin-1是一个多功能蛋白，除了接受自噬信号，它还可以接受很多其它的信号对自噬进行调节，越来越多的证据表明，beclin-1可能是自噬的“守门人”。
自噬体的发生：
目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。
当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membranesource（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中（phagophore到autolysosome），VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的跨膜蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被WesternBlot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。
自噬与细胞死亡的关系：
有必要说明一下的是，细胞死亡是一个非常复杂的过程，为了研究方便，需进行分类，但我们思考时不要局限于这些人为的分类，而应注重于现象本身来研究其背后的机制。
一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡，并把细胞的死亡方式分为2类：
坏死和凋亡，因为两者有着明显的区别，其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性，内容物被释放出来，染料可自由进入细胞，而凋亡细胞保持完整，无内容物释放，染料也被排斥。
很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡，这将在后面一一介绍，如同刚刚说明的那样，这些实验只能说明细胞膜的通透性（必要条件，不是充分必要条件），而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。
一般认为坏死是被动的，不可控的，而凋亡是主动的，可控的。
为了强调这一点，凋亡被定义为程序性细胞死亡（programcelldeath，PCD）。
但无论是坏死还是凋亡，都是一个过程，是需要时间的（尤其是凋亡，从启动到完成，细胞要执行很多反应），而且细胞死亡后都有“尸体”。
在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）,核破裂（karyorhexis）、细胞皱缩（shrinkage）、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡（autophagiccelldeath，ACD），它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为TypeIIcelldeath，相应的，凋亡为TypeIcelldeath，坏死为TypeIIIcelldeath。
尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。
到底是Celldeath
by
autophagy（自噬引起死亡）还是Celldeath
with
autophagy（死亡时有自噬发生，但不是直接原因）？
对此，自噬研究领域“大牛”级专家LevineBeth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。
由于在形态学上2者无明显区别，但通过阻断自噬，观察细胞的结局可区分开来：
Celldeath
autophagy细胞存活，而Celldeath
autophagy细胞死亡。
Autophagiccelldeath：
thestoryofamisnomer.pdf
自噬与肿瘤的关系：
与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。
无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。
因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；
如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。
同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库”。
如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。
更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强
，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagicflux），广泛用于自噬形成的监测。
自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。
鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处：
1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。
2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。
由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。
研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。
参考文献：
Autophagyandtoll-likereceptors：
Anewlinkincancercells.pdf
Autophagyfightsdiseasethroughcellularself-digestion.pdf
Roleandregulationofautophagyincancer.pdf
Roleofautophagyincancer.pdf
AutophagyandCellDeath：
NoLongeratOdds.pdf
Autophagyandcancer：
Dynamismofthemetabolismoftumorcellsandtissues.pdf
自噬的研究方法：
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
（一）自噬诱导剂
1）BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：
模拟内质网应激
2）Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化锂）：
IMPase抑制剂（即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle'
s平衡盐溶液：
制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：
ClassIPI3KPathway抑制剂
5）Rapamycin：
mTOR抑制剂
6）XestosponginB/C：
IP3R阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-Methyladenine（3-MA）：
（ClassIIIPI3K）hVps34抑制剂
2）BafilomycinA1：
质子泵抑制剂
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：
Lysosomallumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：
包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1）观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。
Phagophore的特征为：
新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。
自噬体（AV1）的特征为：
双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。
自噬溶酶体（AV2）的特征为：
单层膜，胞浆成分已降解。
（autophagicvacuole，AV）
2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。
无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；
自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3）利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成：
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（Note：
LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。
方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。
）
4）检测长寿蛋白的批量降解：
非特异
5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：
包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
6）CellTrackerTM
Green染色：
主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。
由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：
溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM探针：
有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：
载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：
特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：
定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：
内质网腔
【Note：
这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理】
自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法：
（1）△ψm
dissipation（线粒体跨膜电位的消失）：
TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。
（2）PhosphatidylserineExternalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：
AnnexinV-FITC（绿色）染细胞膜。
（3）检测线粒体产生的ROS：
无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidiumbromide，溴乙啡啶），发红色荧光。
NAO（nonylacridineorange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。
（4）线粒体IMS蛋白的释放：
AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。
（5）Capase3a染色：
用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。
（6）细胞膜完整性检测：
DAPI（蓝色）、Hoechst33342或PI（红色）染核。
胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexinV。
【如何用实验区分Celldeathbyautophagy和Celldeathwithautophagy】
第一步：
利用上述方法证实细胞死亡
第二步：
证实细胞死亡前发生了自噬
第三步：
在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡
第四步：
利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬
第五步：
细胞存活则为Celldeathbyautophagy，反之，细胞死亡则为Celldeathwithautophagy。
MethodsforAssessingAutophagyandAutophagicCellDeath.pdf
CytosolicLC3RatioasaSensitiveIndexofMacroautophagyinIsolatedRatHepatocytesandH4-II-ECells.pdf
自噬领域的牛人一BethLevine
//www.utsouthwestern.edu/utsw/cda/dept131456/files/181499.html
以autophagy命名的杂志
自噬体的检测
自噬体的检测对研究自噬尤为重要①以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测（俗称检测自噬体的金指标）。
在透射电镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合，消化，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。
②自噬体膜标志性蛋白质的检测。
自噬体膜上标志性蛋白质有Apgl2-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3（LC3）。
Apgl2和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。
LC3是酵母菌自噬基因（Apg7/Apg8）在哺乳动物中的同源物，和前者相比，LC3除了定位在自噬体分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂（PE）结合的形式（LC3-PE）存在于自噬体形成各阶段的内外膜上，在自噬溶酶体膜上也可见。
通过与绿色荧光蛋白（GFP）结合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP，即可实现对自噬体的检测。
③单丹（磺）酰戊二胺（MDC）染色法。
是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。
自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统（Apg8）是位于自噬囊泡膜上与IVIDC特异结合的生化标志，通过荧光染色，在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。
④间接自噬体检测法。
自噬溶酶体及其不能降解的产物—残体的检测。
自噬体和溶酶体融合后，除上述的LC3-GFP法检测外，还有吖啶橙染色法。
它是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针，在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。
对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。
自噬的抑制
根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。
目前常用的一些抑制药物如下：
（1）对自噬体形成的抑制：
主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA,Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。
3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。
另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002也可用作Autophagy的抑制剂。
（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：
对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。
巴伐洛霉素A1（BafilomycinA1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。
当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。
有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。
这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。
（3）对溶酶体降解的抑制:
自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。
对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。
因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、PepstatinA等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。
E64d和PepstatinA均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：
1的比例联用可以抑制自噬。
有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及PepstatinA，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。
大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）
微自噬（Microautophagy）：
是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式。
分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediatedautophagy，CMA）：
一些分子伴侣，如hsc70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
另外，几个与phage相关的概念：
吞噬（phagocytosis）：
细胞主动吞掉胞外的细菌、碎片、或其它细胞。
吞饮（pinocytosis）：
胞外的液体
异噬（heterophagy）：
吞噬、吞饮的统称，强调所吞内容物来自细胞外，它们都是单层膜的液泡。
自噬体（autophagosome）形成后，可与吞噬泡或吞饮泡融合，然后再与溶酶体融合，但这一过程的证实还需更多的实验来支持。
自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融
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