氨基酸工艺学实验.docx

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氨基酸工艺学实验

氨基酸工艺学实验

实验名称：

1.淀粉颗粒形态学观察及淀粉液化

2.甲醛滴定法测定氨基酸含量

学院生物与食品工程学院

年级2010级专业生物工程

班级生工101学号060510106

学生姓名葛俊伦

指导教师王立梅

实验一淀粉颗粒形态学观察

及淀粉液化

一实验目的

观察不同种类淀粉颗粒的形态

掌握用酶水解法水解淀粉制备水解糖的原理及方法。

二原理概述

淀粉的糊化：

若将淀粉乳浆加热到一定温度，淀粉粒内结晶区的氢键被破坏，淀粉不可逆地迅速变成粘性很强的淀粉糊，透明度也增高，此时虽停止搅拌，淀粉再也不会沉淀。

这种粘稠的糊状物称为淀粉糊，这种现象称为糊化作用，发生此糊化现象所需温度为糊化温度。

淀粉的液化：

指利用酸或者淀粉液化酶使糊化淀粉水解成糊精和低聚糖等的过程，此过程中，淀粉粘度大为降低，流动性增高，故而工业上称之为液化。

淀粉的糖化：

液化结束后，迅速将料液用酸调节pH至4.2-4.5，同时迅速降低温度至60摄氏度，加入糖化酶，保温数小时后，用无水乙醇检验有无无糊精存在。

三实验材料

试剂：

玉米淀粉，小麦淀粉，蒸馏水，碘液，淀粉酶

仪器：

烧杯，玻璃棒，电炉，载玻片，盖玻片，显微镜

四实验步骤

（一）淀粉形态学观察

1.将淀粉制成2%浓度的淀粉乳

2.滴于载玻片，盖上盖玻片，于40倍显微镜下观察，拍照

（二）淀粉乳化液化

1.将淀粉制成30%浓度的淀粉乳，pH6.5,加入浓度为0.01M（1.1g/L）的氯化钙溶液

2.将淀粉乳放电炉上边加热边搅拌，观察糊化状态，同时碘液检查

3.糊化后（约63℃，加入淀粉酶（15U/g淀粉）维持30min结束，碘液检查

五注意事项

淀粉乳糊化时，要受热均匀，不宜直接用电炉加热，而应该使用水浴法加热，同时糊化过程中要防止淀粉的老化

六实验结果与现象分析

（1）40倍显微镜下形态学观察结果

图1小麦淀粉图2玉米淀粉

现象分析：

从谷物的电镜扫描图观察可知，不同谷物的淀粉颗粒大小明显有差异。

从上图可知，小麦淀粉颗粒较大，而玉米淀粉颗粒较小；两者颗粒的形态也明显不同，小麦淀粉的颗粒多为圆形，而玉米淀粉的颗粒为多面体。

（2）淀粉乳化观察

淀粉乳

糊化液

液化液

颜色

蓝黑色

蓝黑色

深棕色

a淀粉乳蓝黑色

初始时，淀粉颗粒不溶于水，在冷水中形成悬浮液，碘液反应为蓝黑色

b糊化液蓝黑色

加热糊化中，随着糊化过程的进行，粘度逐渐上升，搅拌较为费力，逐渐形成一种糊状的粘稠液体，碘液反应为蓝色，说明此时淀粉链尚未断裂。

c液化液深棕色

加入酶后的糊化液经过搅拌形成液化液，粘度下降，碘液反应为紫红色，说明此时的淀粉链已经断裂成较小的分子。

现象分析：

依据淀粉吸附碘分子的呈色反应来判断淀粉液化程度，淀粉分子链的长短与呈色反应有如下关系：

淀粉分子链（以葡萄糖计）

>45

40

36

31

12

9以下

呈色

蓝色

蓝紫

深棕色

红色

淡红

碘液本色

由实验现象观察可知，最初的淀粉乳分子链应>45，故而呈蓝色，随着糊化的进行，糊化液中淀粉的结晶结构受到破坏，外膜破裂，但是淀粉分子链未真正打开，故此时的碘液仍呈蓝色。

加入淀粉酶后，糊化后的淀粉分子直接暴露在酶分子作用下，分子迅速断开，最终形成含有少量葡萄糖的低分子糊精溶液，粘度大幅下降。

实验二甲醛滴定法测定氨基酸含量

一实验目的

初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点

二原理概述

水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。

甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N（CH2—OH）2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。

若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。

若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。

脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。

三实验材料

试剂:

1、0.5%酚酞酒精溶液

称0.5g酚酞溶于100ml60%酒精中。

2、0.05%溴麝香草酚蓝溶液

取0.05溴麝行草酚蓝溶于100ml20%乙醇溶液中。

3、1%甘氨酸溶液

取1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。

4、标准0.100mol/L氢氧化钠溶液

5、中性甲本醛溶液

取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LNaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。

实验器具:

锥形瓶、碱式滴定管、移液管洗耳球、天平、容量瓶、试剂瓶、量筒、玻棒、烧杯

四实验步骤

1.将斜面菌种扩培至小试管，并观察斜面菌种形态.

2.将小试管菌种扩培至三角瓶发酵（盖上纱布），并观察液体菌种形态.

3.将发酵液离心、浓缩，再用等电点提取，获得粗谷氨酸，并在结束时用显微镜观察结晶.

4.用甲醛滴定法测定总氨基酸量:

（1）取3只100ml锥形瓶，按下表加入试剂。

锥形瓶编号

试剂

样品1

样品2

空白

0.1%甘氨酸

1%甘氨酸溶液或样品（ml）

2.0

2.0

—

2.0

蒸馏水（ml）

5.0

5.0

7.0

5.0

中性甲醛溶液（ml）

5.0

5.0

5.0

5.0

0.05%溴麝香草酚蓝溶液（滴）

2

2

2

2

0.5%酚酞乙醇溶液（滴）

4

4

4

4

（2）混匀后用标准0.100mol/L氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH8.7~9.0）

（3）结果计算

V（NaOH）*0.0200mol/L

标准甘氨酸氨基氮的回收率=———————————*14.008

理论计算值

理论计算值：

取用氨基酸的体积乘以浓度，再乘以14.008

V（NaOH）两次测定所用氨基酸的体积的平均值

每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为

（V1-V2）*M（NaOH）

mg=———————————*14.008

V样

式中：

V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）；

V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）；

1.4008为1ml0.1mol/L氢氧化溶液相当的氮量（mg）

五注意事项

利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。

随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。

六思考题

　1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么

水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。

甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N（CH2—OH）2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。

　2、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？

因为甲醛滴定的突跃范围不大，而且在碱区，超出了多数指示剂的变色范围，所以用一般的指示剂是无法看到终点现象的。

七实验结果与现象分析

实验现象：

1）液体菌种

2）结晶观察

由图可明显观察到瓶底的结晶现象，但是由于育晶时间较短，也未加入晶种，故而本次结晶形成的晶型多为β型，呈粉针状，轻微晃动三角瓶，结晶就悬浮起来，质量较轻。

3）滴定结果

滴定前：

微黄色滴定后：

微紫色

4）氨基酸总量计算

序号

空白

样品1

样品2

1%甘氨酸

0.1mol/LNaOH（ml）

0.025

0.91

0.98

2.45

V（NaOH）*0.0200mol/L

标准甘氨酸氨基氮的回收率=———————————*14.008

理论计算值

理论计算值=V（甘氨酸）*M（甘氨酸）*14.008

代入数据，回收率=2.4%

故标准甘氨酸氨基氮的回收率为2.4%

（V1-V2）*M（NaOH）

mg=—————————*14.008

V样

代入数据，mg=0.612

故甲醛滴定的每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为0.612。

现象分析：

根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的优缺点。

优点：

使用该方法检测氨基酸较为简便，尤其是当样品中只有一种氨基酸的时候，可以直接通过滴定所使用的NaOH的量来计算氨基酸的含量，非常简便快捷。

缺点：

当样品中含有多种氨基酸时，就不能用该法测定多种氨基酸混合液中每种氨基酸的含量，只能测出氨基酸的总量。

并且脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。

三实验小结

这次实验是我们大学生涯的最后一次实验，周期很长，内容也比较丰富。

本次实验主要是对课题堂上学习的知识进行进一步的了解和熟知。

这次实验分成两部分，一部分是淀粉颗粒形态的观察，另一部分是甲醛滴定法测定氨基酸含量。

实验总的来说没有什么难度，主要是锻炼下大家的操作和对课本上内容的稳固：

淀粉粒的形状，淀粉糊化、液化的变化情况。

我们这门科目主要是对氨基酸的学习，当然要熟悉氨基酸的测量方法。

虽说实验的难度不大，但是我们进行的也不是很顺利，期间各种状况频出。

如：

配制培养基时，实验室的电子秤的量程没有达到实验的要求，我们只能凭感觉进行加入；加水时由于操之过急导致烧杯上层出现好多泡沫，最后只能默默等待它的消失；在摇床培养时，有的同学最后由于瓶子歪倒导致培养失败，这应该是其他同学操作时导致的；淀粉颗粒形态学观察中，由于实验室显微镜数量少，坏的还多，我们组观察室很难找出清晰的画面，最后换了个显微镜，才找到清晰的画面；在淀粉糊化过程中，由于我组选择的是30%的淀粉乳，浓度较高，故而在糊化过程中，随着糊化的进行，液体变得异常粘稠，同时加热的烧杯又十分烫手，搅拌十分艰难。

于是全组同学便轮流进行搅拌，最终才将淀粉糊化好；还有甲醛法滴定实验中，我们将滴定出的结果带入公式中计算发现，数据非常小。

同学们都猜测可能是操作有误或者酶失活了，但最终经老师的探究下，我们才发现是由于试剂配制失误。

虽然实验中出现了许多问题，但是所幸的是小组成员的同心协力及老师的耐心讲解。

实验中不仅只有困难我们也有惊奇，比如糊化时，浓度很高搅拌的很艰难，加入淀粉酶后很快就变得很顺畅；还有配制培养基时，大家通力合作，一起称量，一起搅拌，其乐融融，好不欢乐。

大学的最后一个实验我们很珍惜，也很用心。

因为这次实验不仅可以使我们所学的知识得到巩固，更能锻炼我们的操作和动手能力。

实验虽说不难，但是时间很长，所以有的时候会忘记一些实验要点，因此希望老师下次还是不要把实验周期拉得这么长，集中一段时间既能让我们专心致志，也不会耽误老师和同学们的时间。