苹果皮葡萄皮沙果皮表面酵母菌分离纯化Word文档下载推荐.docx

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1前言2

2酵母菌的简单介绍【8】3

2.1特征3

2.2生殖4

2.3酵母菌的生长条件5

3材料与方法【9】【10】6

3.1材料6

3.2方法6

3.2.1分离6

3.2.1.1原理6

3.2.1.2培养基7

3.2.1.3制作培养基的过程【11】【12】7

3.2.1.4灭菌【12】8

3.2.1.5步骤10

3.2.1.6划线法【１３】11

3.2.2鉴定13

3.2.2.1鉴定依据与原则13

3.2.2.2鉴定步骤【14】【1５】13

4结果与分析16

4.1分离16

4.2鉴定16

5讨论17

6参考文献18

1前言

酵母，是一种单细胞真核微生物，也是人类实践活动中应用较早的一类微生物。

酵母菌在自然界中的分布很广，主要是生长在偏酸性的高糖环境中，在水果，蔬菜的表面和果园的土壤中较为常见。

酵母菌【1】的种类很多，也与人类的关系密切。

千百年来,酵母菌及其发酵产品大大的改善和丰富了人类的生活，如酿酒,面包的制作，甘油的发酵,石油的脱蜡,单细胞蛋白的生产，从酵母菌中提取核酸，麦角甾醇，细胞色素C和一些生化药物，以及近年来将酵母菌作为遗传工程中具有良好发展前途的受体菌等【2】。

特别是SCP的生产上,酵母菌具备无毒,易消化吸收，必需氨基酸的含量丰富,核酸含量较低，口味好，制造容易和价格低廉的优势。

此外，还可以利用无机氮源或尿素来合成蛋白质，因此，自然成了目前最重要的单细胞蛋白的来源【2】【3】。

酵母菌在发酵工业中的应用最为广泛，但随着发酵理论的建立和生产发展，给古老的发酵工业注入了新的活力，也带来了挑战，在使得发酵工业从传统的经验式生产走向新的、主动控制的工业化生产同时，提出了新的要求。

起初，优良的酵母菌株是靠分离筛选的方法得到的，但是单靠分离筛选到的酵母菌株并非一切特性都符合理想要求，适合所有的场合使用，因此，酵母菌种的改良工作显的尤为重要【4】。

自然界的菌种资源虽然十分丰富,但是要设法从其中筛选到较为理想的菌种并非易事.由于酵母菌有一系列非常独特的生物学特性，因其在研究现代遗传学和其它许多重要的生物学基本理论问题中有重要意义【２０】，所以随着对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代生物学和生物工程学的发展，而且为酵母菌的选育工作提供了丰富的理论基础，使选育工作向着从低效到高效，从随机到定向，从近缘到远缘杂交的方向发展。

定向培育是微生物工作者向长期以来的一种理想，当前发酵工业和其它微生物生产部门所使用的高产菌株，毫无例外的都是通过生物学处理然后经选育而明显提高其生产性能的。

酵母菌种资源的开发及改良是酵母菌利用中的一项长期不可缺少的工作，自从遗传工程问世以来，使酵母菌遗传育种工作上了一个新的台阶，为选育工作开辟了广阔的天地【4】【5】。

传统的育种方式是先设法得到出发菌株，再进行定向培养和选育，这为本次实验提供了理论依据和基础。

具体步骤是：

利用酵母菌的某种特殊生理要求先进行富集培养，然后从众多的微生物中分离出酵母菌；

经扩大培养后，根据分离所得酵母菌的形态特征，查找权威的资料，对其进行鉴定和确认【6】【7】。

只有不断的选育优良的菌种，才能开发出新产品，生产出好产品，适合新的生产。

本文及相关实验立足于此，旨在探测苹果皮，葡萄皮，沙果皮上主要的酵母菌菌群，尝试从苹果皮，葡萄皮，沙果皮中分离野生酵母菌，从而选育适合于不同生产的改良原始菌株,为下一步菌种改良做基础工作。

2酵母菌的简单介绍【8】

2.1特征

多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。

一些酵母在昆虫体内生活。

酵母菌是单细胞真核微生物。

酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。

比细菌的单细胞个体要大得多，一般1~5微米5~30微米。

酵母菌的各种形状

酵母菌无鞭毛，不能游动。

　酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。

有些种类培养时间长了，菌落皱缩，有特殊酒香味。

酵母菌的结构

2.2生殖

酵母可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。

无性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体分离。

在营养状况不好时，一些可进行有性生殖的酵母会形成孢子（一般是四个），在条件适合时再萌发。

一些酵母，如假丝酵母（或称念珠菌，Candida）不能进行无性繁殖。

酵母菌的无性繁殖有出芽繁殖和分裂繁殖两种。

出芽繁殖是酵母菌中最普通的繁殖方式。

先在一端生一小突起，称为生“芽”，同时进行核分裂，核分裂后，一个子核留在母细胞内，另一个子核进入芽内，芽渐膨大，以后母细胞与“芽”接触处细胞壁收缩，分隔形成子细胞，有时在尚未脱离母细胞的子细胞上又长出新芽。

如此连续进行，可相互连接而成“假菌丝”。

有的酵母菌如裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces）进行分裂繁殖，在分裂过程中，首先核分裂，然后中间出现横隔而形成两个子细胞。

少数酵母菌进行有性繁殖，产生子囊孢子等。

子囊孢子也可由单雌生殖形成，即子囊孢子的形成无需经过两细胞间结合，而是在一个细胞内，首先进行核的分裂，分裂后的子核和一部分细胞质的外围生出细胞壁，成为子囊孢子。

有些酵母从来不形成子囊和子囊孢子，如红酵母属（Rhodotorula）。

2.3酵母菌的生长条件

　　营养:

　酵母菌同其它活的有机体一样需要相似的营养物质，象细菌一样它有一套胞内和胞外酶系统，用以将大分子物质分解成细胞新陈代谢易利用的小分子物质。

　　水分:

象细菌一样，酵母菌必须有水才能存活，但酵母需要的水分比细菌少，某些酵母能在水分极少的环境中生长，如蜂蜜和果酱，这表明它们对渗透压有相当高的耐受性。

　　酸度:

　酵母菌能在pH值为3-7.5的范围内生长，最适pH值为pH4.5-5.0。

　　温度:

在低于水的冰点或者高于47℃的温度下,酵母细胞一般不能生长，最适生长温度一般在20℃~30℃之间。

　　氧气:

酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和水。

在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长较快。

3材料与方法【9】【10】

3.1材料

原料：

成熟的苹果、葡萄、沙果、马铃薯。

药品和试剂：

琼脂、乳酸、蒸馏水、0.1%美蓝液等、葡萄糖、酒精、无菌水。

主要仪器和设备:

显微镜、恒温培养箱、高压蒸气灭菌锅、干热灭菌器、无菌培养皿（40个）、接种环、1ml的无菌吸管（6个）、试管（30个）、250ml的三角烧瓶（20个）等。

3.2方法

3.2.1分离

3.2.1.1原理

　大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5一6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。

（故用乳酸马铃薯葡萄糖培养液进行富集培养【3】，再在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上反复划线分离，纯化分离不得少于3次，直到分离出纯菌株）

3.2.1.2培养基

　马铃薯葡萄糖琼脂培养基：

马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。

制法：

（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。

（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115摄氏度条件下高压灭菌20分种。

　　（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

乳酸马铃薯葡萄糖培养液：

配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸的量加入，并分装试管。

3.2.1.3制作培养基的过程【11】【12】

（一）称量根据用量按比例依次称取成分，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入搪瓷缸。

（二）溶解在搪瓷缸中加入少于所需要的水量，加热，加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。

加热时应注意火力，勿使培养基溢出。

溶好后，补足所需水分。

（三）调PH用1mol/LNaOH或1mol/LHCl把PH调至所需范围。

（四）过滤趁热用多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察

（五）分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内，分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1．液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

2．固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。

分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。

3．半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

（六）加棉塞分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。

（八）保存灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。

3.2.1.4灭菌【12】

在同样的温度下，湿热的杀菌效果比干热好，其原因有：

①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。

湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，因较大同一温度的干热空气中易于凝固。

②湿热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度。

因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。

③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。

湿热灭菌的方法（高压蒸汽灭菌法）：

压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。

其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。

目前使用的压力灭菌器可分为两类：

下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器。

适用于耐高温、耐水物品的灭菌。

使用程序和注意事项：

1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，水过多会延长沸腾时间，降低灭菌功效；

水过少，就有将灭菌器煮干而引起炸裂的危险。

2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。

加盖，注意平稳端正，扭紧螺丝，保证紧密封闭，勿使漏气。

3．供电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，排气时间约5min，关上排气阀。

注意：

一定要将锅内冷空气全部排出，否则后来压力和温度的关系发生了变化，如压力达到了1kg∕㎝3，而温度达不到115℃，由于温度偏低影响灭菌效果。

、

4．继续加热使温度升至115℃，压力达到1kg∕㎝3时，控制热源，维持压力至所需时间20min。

5．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。

6．做斜面试管培养基，取出后立即摆成斜面。

7．高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。

干热灭菌法：

干热灭菌比湿热灭菌需要更高的温度与较长的时间。

（1）烧灼：

烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。

（2）干热灭菌器：

可杀死一切微生物，包括芽胞菌。

不能在火焰上灼烧的灭菌的器皿，放在干热灭菌器中加热160～180℃2小时进行灭菌。

大的物品或难于传热的物品，则需要更长刚的时间。

棉花和纸在180℃以上会烘焦，因此有绵塞和有纸包扎的物品，进行干热灭菌时，不能超过180℃。

干热灭菌只适用于玻璃，金属和木质的空器皿，如果器皿中含有水分或培养基，都不能用此法进行灭菌。

1.洗涤清洁准备灭菌的玻璃器皿，要经过充分干燥（可置45～60℃烘箱烘干）。

2.培养皿每5～6个用报纸包好或放在特制的铁盒内。

吸管先在上端距管口2～3cm处用铁丝疏松地塞上2cm长的一段棉花，然后用4～5cm宽的长纸条，成约为46°

的角度逐支以螺旋式包扎起来，上剩余纸条折叠打结。

包扎好的吸管可直接放在干热灭菌器内灭菌，或放在铁盒内进行干热灭菌。

带有橡皮管或橡皮塞的玻璃器皿不能用干热灭菌。

3.将包扎好的玻璃器皿放入灭菌器内，注意不能放的过满，妨碍气流流通，关闭器门，打开通气孔，接通电源加热，等灭菌器内温度达到80℃时，关闭通气孔，继续加热，待温度升到160℃时，控制温度不变，维持2小时，关闭电源。

4.灭菌后切不可立即打开器门，必须等器内温度逐渐下降到60℃以下，才能打开器门，在灭菌过程中，温度上升或下降都不能过急，否则玻璃器皿容易炸裂。

灭国菌的器皿在使用前不应打开铁盒或包装纸，以免空气中的杂菌的污染。

3.2.1.5步骤

a.接种:

各取成熟的苹果、葡萄、沙果的小块果皮，分别直接接入250ml锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，每个样品做两个，即共6个250ml锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液，两个加入苹果皮，两个加入葡萄皮，两个加入沙果皮置28～30℃的恒温摇床中，转速为120，震荡培养48小时，可见培养液变混浊。

b.培养:

用无菌吸管取上述培养后培养液1ml，注入另6瓶乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28～30℃的恒温摇床中，转速为120，再震荡培养48小时

用1ml的无菌吸管单独吸取培养液直9ml的无菌水中便是10-1如此稀释10-2、10-3。

c.分离:

马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管吸取10-3培养液至培养基表面，用无菌的玻璃刮产迅速涂抹均匀，而后6个培养皿做好标记放置恒温箱培养大约48小时（培养皿倒置），菌落长出后，观察菌落，并镜检菌体，一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是纯培养,如果结果复杂，未得纯培养，可进行再次分离培养，直到纯化为止,步骤如下：

（1）将融化了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿大约15ml冷凝成平面，记上标记。

（2）用灭菌的接种环挑取培养好的培养皿中长出来的菌落，在培养基上轻轻划线，注意不要用接种环将平板表面划破。

用划线法分离，从而得到单个菌落。

挑取单个菌落，反复多次划线分离纯化，直到获得纯培养。

（3）将纯培养移到斜面培养基上，必须用无菌接种环沾取纯菌落少许，在斜面上划线（波浪曲线）置恒温箱中培养，长出菌落后即可供研究观察用的纯菌。

试管用记号笔注明菌号接种日期。

3.2.1.6划线法【１３】

菌种的分离纯化技术——平板划线法

实验目的

了解平板划线分离纯种的原理，并熟练掌握该操作法。

实验内容

1．培养基平板的制备。

2．用平板划线分离法分离混菌。

实验原理

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。

其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C区）是逐级稀释的过渡区，第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。

为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。

实验器材

酵母菌

马铃薯葡萄糖琼脂培养基

无菌培养皿，电磁炉，酒精灯，接种环等。

实验步骤

1．融化培养基：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基放置电磁炉上加热至融化。

2．倒平板：

待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒平板（每皿约15m1），平置，待凝固。

倒平板的方法：

右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；

然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞（也可将瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。

如果三角瓶内的培养基一次用完，瓶塞则不必夹在手中）。

左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。

各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。

4．划线操作

（1）挑取他含菌样品：

选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。

（2）划A区：

将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯（这时皿盖朝上，仍留在酒精灯旁），右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线（线条多少应依挑菌量的多少面定）。

划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。

在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方（不要放入皿盖内），以防止杂菌的污染。

（3）划其他区：

将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。

再从B区作C区的划线。

最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。

随即将皿底放入皿盖中。

烧去接种环上的残菌。

5．恒温培养：

将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24hr后观察。

平板划线分离法

左：

操作示意中：

平板分区右：

划线结果

3.2.2鉴定

3.2.2.1鉴定依据与原则

根据实验结果，查找权威性的鉴定资料，在相关检索表中找出与实验结果相对应的已知种，如果没有显著的差别，即为同种；

差别不大，可作为最近似种的变种；

与任何已知菌不相符合，即为新种【14】。

不同的微生物往往有自己不同的重点鉴定指标，对于酵母菌，本实验用形态特征鉴定。

3.2.2.2鉴定步骤【14】【1５】

a.分离培养吸取10-3培养液0.1ml至马铃薯琼脂琼脂（PDA）培养基表面，用无菌玻棒在培养基表面轻轻涂布均匀。

将接种好的培养基倒置于28℃恒温箱，培养24～48h。

取出培养基，对菌落仔细观察分析，挑选5个左右菌落涂片染色，显微镜下观察。

b.细胞形态取菌接入新鲜（PDA）斜面上，28℃恒温静置培养，2d后涂片镜检。

观察记录细胞的形态、大小和出芽方式。

观察:

用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

酵母菌形态的观察【1２】【1６】【1７】

（一）原理和目的

酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显分化，菌体比细菌较大。

繁殖方式也较复杂：

无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；

有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。

用美蓝染色制成水浸片，不仅可观察其外形，而且可以区分死活细胞。

通过实验，掌握观察酵母菌的基本方法，并观察其形态特征。

（二）材料和用具

0.1％吕氏美蓝染液。

显微镜；

载玻片；

盖玻片等。

（三）方法步骤

1）在载玻片中央加一滴0.1％美蓝染色液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。

然后按无菌操作法取在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养了48小时的酵母少许，放在美蓝染色液中，使菌体与染色液均匀混合。

2）取盖玻片一块，小心地盖在液滴上，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。

3）将制好的水浸片先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞，因为活细胞的新陈代谢不停地进行着，所以细胞内氧化还原值（rH）颇小，而还原力强，若有无毒的染料进入细胞，即被还原脱色，但死细胞及代谢缓慢的老细胞无此还原力。

美蓝无毒，且能为活细胞还原成无色，故可用以区别细胞的死活。

但美蓝浓度、作用时间等均有影响，应加注意。

结果：

透明的是活细胞，染成蓝色的是死细胞

c.菌落形态将培养后的菌种划直线接种于新鲜（PDA）斜