消毒液消毒效力及有效期验证Word文件下载.docx
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2
大肠埃希菌
3
枯草芽孢杆菌
4
白色念珠菌
设备
表2设备清单
设备名称
设备型号
设备编号
生化培养箱
SHP-08
霉菌培养箱
MJP-15
5
6
7
7.1
7.2
实用标准文案
8验证程序
8.1为了确认消毒剂的消毒效力，通过定量悬浮试验法和表面实验法进行验证试验。
1）中和剂的选择：
通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌及其恢复期培养是否有害或不良影响。
菌种：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。
消毒剂的配制浓度：
乙醇溶液配制成75%的浓度、新洁尔灭配制成0.1%的浓度、84消毒液配制成0.5%的浓度。
中和剂的选择：
乙醇采用3%吐温80为中和剂，新洁尔灭1%的卵磷脂+0.1%吐温80为中和剂，84
消毒液采用1.5%硫代硫酸钠为中和剂。
3%吐温80配制方法：
取吐温803.0ml，加纯化水至100ml,121C高压灭菌15分钟，即可。
1%的卵磷脂+0.1%吐温80配制方法：
卵磷脂1g,吐温800.1ml加蒸馏水至100ml,121C高压灭菌15分钟，即可。
1.5%硫代硫酸钠配制方法：
取硫代硫酸钠1.5g,加纯化水稀释至100ml,121C高压灭菌15分钟，即
可。
进行中和剂选择试验时需设置平行6组实验：
第一组消毒剂+菌悬液；
第二组（消毒剂+菌悬液）+中和剂；
第三组中和剂+菌悬液；
第四组（消毒剂+中和剂）+菌悬液；
第五组0.9%氯化钠溶液+菌悬液；
第六组稀释液+中和剂。
•第1组
目的：
观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。
操作方法：
吸取消毒剂4.5ml于试管内，吸加0.5ml菌悬液（含菌量为1X108cfu/ml〜5X108cfu/ml）,混匀。
作用10分钟，吸此样液0.5ml至含有4.5ml稀释液试管中混匀。
吸取该最终样液0.5ml，接种
于平皿中，做活菌培养计数。
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌用TSA培养基；
白色念珠
菌用SDA培养基。
•第2组
观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。
吸取消毒剂4.5ml于试管中，加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸此样液0.5ml，加
于含4.5ml中和剂溶液管中，作用10分钟，吸此样液0.5ml至含有4.5ml稀释液试管中混匀，吸取
该最终样液0.5ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
•第3组
观察中和剂是否有抑菌性。
吸取中和剂4.5ml于试管内，再吸加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取该最终样液0.5ml，用稀释液做10倍系列稀释至10-3，取相应稀释级各0.5ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
•第4组
观察中和产物，或未被完全中和残留消毒齐叹寸试验菌的生长繁殖是否有影响。
吸取中和产物溶液（以1份消毒剂加9份中和剂，作用10分钟配制而成）4.5ml于试管内，再吸加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取该最终样液0.5ml，用中和产物溶液做10倍系列稀释，稀释至10-3，取相应稀释级各0.5ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
•第5组
作菌落数对照用。
吸取稀释液4.5ml于试管内，再吸加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取该最终样液0.5ml，用稀释液做10倍系列稀释至10-3，取相应稀释级各0.5ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
•第6组
作为阴性对照用。
分别吸取稀释液与中和剂各0.5ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基
15ml〜20ml，培养观察。
如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染，应重新进行试验。
样品培养：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于30〜35C培养3天，白色念珠菌于20〜25C培养5天，培养结束后点计菌落数。
结果判定：
第6组无菌生长
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%，计算公式如下：
（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和
误差率=x100%
3X3组间菌落平均数
第1组无菌生长或仅有少数试验菌菌落生长
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求
表3
第1组平板平均菌落数
>
5
x
（X+5）
y
（y+0.5y）
以上条件均符合要求时，判断所选中和剂及其浓度合格。
2）定量悬浮试验
试验目的：
通过浸泡或液封消毒的消毒剂应通过定量悬浮试验，确定其消毒效力是否符合要求。
操作：
将含菌量为1X108〜5X108cfu/ml的菌悬液0.5ml加入到10ml的消毒剂溶液中，作用5分钟、10分钟、15分钟、20分钟后，取消毒剂与细菌混合样品0.5ml，接种于4.5ml中和剂中，中和10分
钟后，10倍稀释稀释至10-4，取各稀释级1ml分别接种于平皿中，每个浓度平行2个平板。
阳性对照以0.9%氯化钠溶液代替消毒液，同法操作。
结果计算：
计算试验组和对照组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对照值
杀灭对数值（KL）=对照组平均活菌浓度的对数值（NO）-试验组活菌浓度对数值（NX）
可接受标准：
杀灭对数值（KL）应不低于3~5个对数单位。
3）表面试验法
通过擦拭消毒的消毒剂应通过表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。
染菌不锈钢载片制备
将经灭菌的载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌，含菌量为1X108~5X108cfu/ml的菌悬液0.1ml，并均匀涂布于整个载体表面。
滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用，每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。
染菌玻璃载片制备
因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。
进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积（50mmX50mm），标注清晰，菌液滴染操作同染菌不锈钢载
片制备。
操作
•试验组：
将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为5分钟、10分钟、15分钟、
20分钟，作用结束后，用接触碟取样，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌用TSA接触碟取
样，白色念珠菌用SDA接触碟取样。
接触碟取样方法：
打开接触碟盖，使培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟，确保培养基表面与取样表面均匀接触10秒左右，再盖上碟盖。
•对照组：
对照组的活菌浓度计数见表9菌落计数表。
•阴性对照：
用接触碟在已灭菌未染菌的载片上按压取样，操作同上，每种载片及每种接触碟平行制备两个平皿。
4）模拟现场消毒实验
擦拭区域：
微生物检验室不锈钢工作台面、墙面、超净工作台的台面三个区域的表面微生物取样进行擦拭取样。
擦拭方法：
清洁消毒前取灭菌的棉签1支，用灭菌的纯化水浸湿，握住棉签柄，在取样点处选择约25cm2取样面上，以30。
角与取样表面接触，纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签，同法横向擦拭，然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于装有20m灭菌纯化水的瓶中，迅速封口，作为供试液。
实验结束后操作人员按《微生物检验室清洁消毒管理程序（SOP-025）》对洁净区进行清洁消毒，清洁消
毒完毕15分钟后，再用灭菌的棉签按以上方法对以上区域进行擦拭。
每个测试点的瓶子均振摇3分钟，使微生物充分释放。
取以上各瓶供试液分别用0.22um的滤膜全部过滤，过滤完毕取出滤膜菌面朝上贴于TSA培养基平板
上，30〜35C培养3天，点计菌落数。
w25cfu/25cm2。
8.2消毒剂有效期确认试验
1）试验目的：
通过该试验，确定消毒剂在有效期内是稳定的，并且消毒效力不会变化，符合要求。
2）试验操作：
配制75%乙醇、0.1%新洁尔灭、0.5%84消毒液
8.3验证记录：
见表4至表10。
表4中和剂选择实验结果
消毒剂
菌种
稀释
度
结果
3、4、5
组间误差率
结论
第一组
第二组
第三组
第四组
第五组
第六组
新洁尔
灭液
金黄色葡萄球菌
大肠
埃布菌
枯草芽孢杆菌
白色
念珠菌
乙醇
溶液
金黄色匍萄球菌
84
消毒液
金黄色
匍萄球菌
操作人/日期：
复核人/日期:
表5消毒剂定量悬浮试验结果
稀释级
杀灭
对数值
试验组活菌浓度对数值
0.1%新洁尔
灭
10-1
10-2
10-3
10-4
75%乙醇
10一4
结论：
0.5%84消毒
液
表6表面试验法试验记录
不锈钢载片
玻璃载片
对照组
阴性对照组
①
②
0.1%新洁尔火
金黄色葡萄球
0.5%84消毒液
复核人/日期:
操作人/日期:
表7模拟现场消毒实验记录（清洁消毒前）
测试点
菌落数
判定标准
微生物检验室不锈钢工作台面
微生物检验室墙面
微生物检验室超净工作台台面
表8模拟现场消毒实验记录（清洁消毒后）
表9菌种信息
菌种信息
菌种名称：
菌种编号：
菌种代数：
菌种来源：
领用日期：
领用人：
稀释至含菌量小于100cfu
稀释至含菌量小于lOOcfu
表10菌落计数表
菌液名称
10-5
10-6
10-7
10-8
10-7
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