基因工程期末复习整理.docx
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基因工程期末复习整理
动物基因工程
名词解释：
1、体细胞克隆：
以体细胞（包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等）为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。
2、显微注射：
：
在显微操作仪下，将DNA用微吸管注射到处于原核时期受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA复制而整合到基因组，然后将转化后的胚胎移植到受体子宫中继续发育，得到转基因动物。
3、ES细胞：
4、基因打靶：
是指外源DNA通过与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组,整合到预定位点,从而改变细胞遗传特性的方法。
5、基因敲除：
将一个结构已知但功能不祥的基因去除，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除表达机制，从而推测该基因的生物学功能。
6、乳腺生物反应器：
通过转基因技术将外源基因在动物乳腺中高效表达，在乳汁中生产目的产品。
问题：
1、常用动物转基因的方法有哪些？
比较优缺点
显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞法、基因打靶法、精子载体法体、细胞核移植法、磷酸钙共沉淀法。
其中，常用动物转基因的方法有显微注射法、逆转录病毒法、胚胎干细胞介导法。
（1）显微注射法的优点：
操作技术性很强
显微注射法的缺点：
设备昂贵，胚胎死亡率高
（2）逆转录病毒法的优点：
操作简便，可大量感染细胞，形成单拷贝，转化率高
逆转录病毒法的缺点：
没有包装蛋白，不能形成完整的病毒颗粒
2、谈谈如何获得转基因小鼠？
显微注射法：
书118页
逆转录病毒法：
书123页
胚胎干细胞法：
书123页
3、转基因动物有哪些重要的应用？
（书138-143页）
（1）研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质
（2）建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法
（3）改善动物生产性能，提高动物育种效率
（4）作为医用或食用蛋白的生物反应器，可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。
4、比较在细菌、真核细胞和动物个体中表达外源基因的优缺点？
动物：
优点：
目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L以上
缺点：
A、哺乳动物细胞的表达水平低B、高表达细胞株构建复杂C、细胞大规模培养工艺复杂D、哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高
第3章基因工程常规技术
一、名词解释
1．klenowfragment：
DNA聚合酶被枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段，具5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，是分子生物学中的重要工具。
2．Taq酶：
水生栖热菌（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
3．核酸酶S：
来源于米曲霉素（aspergillusoryzas），作用于ssDNA和ssRNA。
4．末端转移酶：
terminaltransferase，来源于小牛胸腺。
是仅存于前淋巴细胞及淋巴样细胞内的一种不同寻常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3’OH末端。
5．碱性磷酸酶（AKP/ALP）：
同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。
每个单体由449个氨基酸组成，同时每个单体均具有一个活性中心。
是能够将对应底物去磷酸化的酶，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
包括BAP（细菌碱性磷酶）和CIP（小肠碱性磷酶）。
6．Plasmid：
质粒，是细菌染色体外的闭合环状的双链DNA分子，主要有F质粒（F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）、Col质粒（大肠杆菌素因子）。
7．表达载体：
具有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的元件的载体。
为了有效的转录，必需有强大的启动子和终止子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SD（RBS）
8．穿梭载体（shuttlevector）：
能在两种宿主生物体内复制的载体，可以运载目的基因穿梭往返两种生物之间。
9．MCS：
多克隆位点，指质粒上的一段DNA，其上包括一序列限制性内切酶位点，以利于外源DNA的插入。
10．Cosmid：
黏粒，柯斯质粒。
一种由质粒和噬菌体联合构建的新载体。
黏粒的基因组包括以下部分：
质粒复制原点、多克隆位点、抗药性基因和λ噬菌体两端的cos位点。
11．YAC：
酵母人工染色体。
利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，克隆能力为200-2000kb。
YAC载体含有的着丝粒,端粒和复制起点三种成份可以满足YAC自主复制，染色体在子代细胞间分离及保持染色体稳定的需要。
YAC以环状方式存在，具有大肠杆菌质粒的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。
12．脉冲电场凝胶电泳：
DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。
该方法可分离长至5Mb的DNA分子。
13．RT-PCR：
反转录PCR，由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
14．RACE：
cDNA末端的快速扩增。
利用PCR技术在已知部分cDNA序列的基础上特异性克隆其5’或3’端缺失序列的方法。
15．差异显示：
利用一系列的oligo（dT）引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。
16．Real-timePCR:
实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
17．基因组文库：
从某种生物体中分离出完整的染色体DNA，并且用限制性内切酶消化到所需的平均长度，连于相应的载体，构建而成。
18.cDNA文库（cDNALibrary）：
含某种细胞特定时间所有的mRNA经逆转录产生的cDNA与相应载体（质粒或噬菌体）连接后，得到的重组克隆的总和
19.滴度：
病毒悬液的浓度，可用pfu（噬菌斑形成单位）表示。
如每微升的噬菌斑形成单位（pfu/μL）。
20.差减cDNA文库：
差减文库也称扣除文库，对存在差异表达的两种材料提取mRNA（或反转录后合成cDNA），用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子（Driver）与含有目的基因的试验方（Tester）进行杂交，选择性的扣除两部分共同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。
21.Southernblotting：
Northernblotting：
都为核酸分子杂交技术。
：
探针与待测核酸序列之间的杂交。
指将核酸转移至固相载体（能吸附核酸的滤膜或滤纸），用探针（酶或同位素等标记的核苷酸片段）去反应，从而实现对核酸进行分析和鉴定的技术。
不同的是，Southern杂交的对象是DNA。
另一个是RNA。
22.缺口平移法：
有DNaseⅠ，PolⅠ，标记dNTP。
23.原位杂交（insituhybridization，ISH）：
探针直接与细胞或者组织中的核酸进行杂交，DNA的变性、杂交及检测等都在载玻片上进行，如菌落杂交、噬菌斑杂交、染色体杂交、组织切片原位杂交、整胚原位杂交。
如果探针是由荧光底物标记，最后的检测可以通过荧光显微镜进行直观观察，称为荧光原位杂交。
24.FISH（fluorescenceinsituhybridization）：
荧光原位杂交技术，是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。
25.基因芯片（DNAmicroarray）：
又称DNA阵列（DNAarray），在玻片、硅片、薄膜等载体很小的基质表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段，形成了高密度的DNA微阵列。
二．简答题
1.基因工程发展过程中标志性的事件有哪些？
1）发现DNA连接酶
2）分离限制性内切酶与逆转录酶
3）体外DNA重组技术的建立及基因工程的诞生
4）DNA测序技术
5）Ti质粒作为植物基因工程的载体
6）PCR技术的发明
2.基因工程的基本原理是什么？
在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液（Mg2+）的混合物中，在耐高温DNA聚合酶的催化下，对一对寡聚核苷酸所界定的DNA片段进行扩增。
这种扩增是通过模板DNA与引物之间的变性、退火（复性）、延伸三步反应为一周期，循环进行，使目的DNA片段得以扩增。
3.简述作为基因工程载体应具备的条件。
1）具有一个或多个限制酶切点，以供外源基因插入其中;
2）具有标记基因，以鉴定重组是否进入受体细胞;
3）能自我复制，否则可能导致重组丢失;
4）对受体细胞无害;
5）大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大不便操作。
4.基因中常用的抗性标记有哪些，工作原理是什么？
抗性标记基因
编码
原理
Ampr
酶
水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性
tetr
1个膜蛋白
阻止四环素进入细胞
camr
乙酰转移酶
生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性
neor（kanr）
氨基糖苷磷酸转移酶
使G418（卡那霉素衍生物）转移酶失活
hygr
潮霉素β磷酸转移酶
使潮霉素β失活
5.质粒DNA的分离提取及纯化的方法有哪些，原理是什么？
提取方法：
方法
原理
碱裂解法
在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA的氢键断裂，致使宿主染色体DNA变性，但闭合环状的质粒DNA由于拓扑缠绕而不能彼此分开。
当以pH4.0的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，质粒DNA迅速恢复原有的构型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
（小量制备质粒DNA）
煮沸法
沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。
当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。
通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。
（对于某些特殊的质粒，只能用煮沸的方法进行提取）
还有酚氯仿裂解法、SDS法、羟基磷灰石层析法等
常用的纯化方法有柱层析法，和氯化铯梯度离心法，二者都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。
具体的氯化铯梯度离心法原理是：
溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。
由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。
最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。
但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。
由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。
6.蓝白斑筛选（α互补筛选）的基本原理是什么？
MCS处具有半乳糖苷酶N端编码基因（lacZ’），宿主菌具有该酶的C端编码基因，二者结合能够分解底物X-gal，产物使菌落显蓝色。
当目的基因插入MCS时，lacZ’失活，无α互补现象，菌落为白色。
7.λ噬菌体载体如何从λ噬菌体改造而来？
与质粒载体相比有何特殊用途？
去除λ噬菌体上的编码溶原生命周期的非必须序列及一些限制性内切酶位点
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