汇总RTPCR详细步骤文档格式.docx

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1）、玻璃器皿，金属及耐250℃物品的处理：

于高温烘箱中干烤，180℃，5小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部。

2）、塑料制品的处理：

0.05-0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜：

●必须保证塑料制品被水浸透，部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5mlPCR管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。

●泡过夜后，用镊子逐个敲去管的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；

尽量敲去枪头的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。

●121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。

●DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

具强挥发性，致癌物，因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。

3）、试剂的配制：

试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾的试剂，然后高压灭菌。

所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。

0.05-0.1‰的DEPC水（三蒸水），磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜，121℃，30分钟高压灭菌。

2.RNA的提取（TRIzol法）：

安全去除细胞生长介质

往细胞培养瓶中加入1mlPBS洗涤单层细胞，不要将细胞破裂，倒出PBS洗涤液

向细胞培养瓶中加入2mlTRIzol，以枪小心吹打，分入2个1.5mlEP管中

室温下培育五分钟（使核蛋白复合物充分分离）时间可能更长30min

向EP管中加入0.2ml氯仿/1mlTRIzol，用力摇晃15秒钟，室温培育三分钟

12000g，4oC离心15min

小心吸取上层无色水样层（0.6ml/mlTRIzol）转移至一新EP管中

加入0.5ml/mlTRIzol异丙醇，室温放置15min

12000g，4oC离心10min，轻轻倒去上清

加入1ml/mlTRIzol75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min，4oC离心5min

弃上清，倒置EP管，5-10min空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水

55℃加热RNA5-10min（提高RNA溶解度），-70℃保存

注意：

异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。

因此，假如去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。

因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离出，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。

3、紫外分光光度法检测RNA浓度

3、琼脂糖凝胶电泳检测（或RNA定量仪器）

1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用；

2）、以DEPC处理的水稀释50хTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1хTAE备用；

3）、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶；

4）、电泳5V/cm电泳20min

5）、电泳图谱：

28s和18s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上

通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。

逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独立的两个步骤：

即RT（将mRNA反转录成cDNA）和PCR（通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA）。

其原理是：

由总RNA或poly（A）+RNA（mRNA）采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因。

（一）、反转录酶的选择：

1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱；

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性；

3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：

在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构；

4．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：

商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

（二）、合成cDNA引物的选择：

1．随机六聚体引物：

当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA；

2．Oligo（dT）：

是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly（A+）尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly（A+）RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小；

3．特异性引物：

最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：

分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要，必须完整，且不被基因组DNA污染。

1．第一链cDNA合成试剂盒（promega公司）

2．dNTPmix：

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM（申能博彩）

3．TaqDNA聚合酶（Takara）

4、特异引物（Invitrogen合成）

5、模板RNA（上次实验提得）

四、实验步骤

1.cDNA第一链的合成

目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

现以promega公司提供的M-MLV试剂盒为例。

（1）在pcr管中，加入0.5μlinhibitor（40U/μl），加入总RNA0.5-2μg，在管中加10μMOligo（dT）12-182μl，补充适量的DEPCH2O使总体积达14μl（<

15μl），轻轻混匀、离心；

（2）70℃加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中，冰浴5min，离心，将液体收至管底，冰浴中加入下列试剂的混合物：

10mMdNTPmix 

1.5μl

5×

PCRbuffer 

5μl

inhibitor（40U/μl） 

1μl

M-MLV反转录酶1μl

DEPC水 

2.5μl

Total25μl 

42℃孵育60min。

（3）于94℃加热3min以终止反应。

（4）-20℃保存备用（第一链反应混合物可在-20℃保存3个月以上）。

2.PCR

（1）取PCR管，依次加入下列试剂：

10×

5μl

Mgcl22μl

dNTP（10mM） 

0.5μl

上游引物（10pM） 

2μl

下游引物（10pM） 

2μl

第一链cDNA 

1μl

Taq酶（1u/μl） 

ddH2O11.5μl

（2）轻轻混匀，离心；

（3）设定PCR程序。

在适当的温度参数下扩增28-32个循环。

条件：

1.94℃5min

2.94℃40sec

3.60℃40sec

4.72℃15sec

5.GoTo2,32cycles

10.4℃Forever

（4）电泳鉴定：

进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

（5）密度扫描、结果分析：

采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描,检测相对表达量。

五、注意事项

1．逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解；

2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；

3．参的设定：

主要为了用于靶RNA的定量，防止假阴性，常用的参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等；

4．防止DNA的污染：

（1） 

可采用DNA酶处理RNA样品。

（2） 

在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。

琼脂糖（agarose）是一种直链多糖，是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。

由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。

琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，不吸附被分离的物质，是一种很好的凝胶剂。

45℃开始形成多孔性刚性滤孔，孔径大小决定于琼脂糖浓度。

DNA分子碱性环境下带负电荷，外加电场作用下，从负极向正极移动，兼具电荷效应与分子筛效应。

不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，以分出不同区带。

EB（溴化乙锭）为扁平状分子，与DNA分子形成EB-DNA复合物，在UV照射下，发射荧光，且荧光强度与DNA质量成正比，以肉眼观察，可检测5ng以上的DNA。

EB分子具有强致癌性，请小心使用。

质粒DNA、微波炉、电泳仪、微型电泳槽、天能凝胶成像系统、三角瓶（250ml）

琼脂糖、50хTAE、6хlodingbuffer、EB母液（0.5mg/ml）

（一）制胶

1．选择大小合适的电泳制胶板，选择孔径大小适宜的点样梳，水平而垂直地架在封好的电泳制胶板的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5－1.0mm；

2．按被分离DNA分子的大小，确定凝胶中琼脂糖的百分含量；

一般情况下，可参考下表：

琼脂糖的含量（%）

分离线状DNA分子的有效围（Kb）

0.3

60~5

0.6

20~1

0.7

10~0.8

0.9

7~0.5

1.2

6~0.4

1.5

4~0.2

2.0

3~0.1

称取适量琼脂糖，加入装有适量1х电泳缓冲液的三角瓶中，摇匀，置微波炉中加热，直至琼脂糖融化均匀（琼脂糖极易暴沸，加热时间不能过长，一般在加热一分钟后，数十秒地进行直至溶解均匀，沸腾时的琼脂糖溶液不能摇晃以免溶液扑出）,加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发；

3．待凝胶溶液冷却至60℃左右时，加入最终浓度为0.5μg/ml的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；

4．待凝胶冷却凝固后，小心拨出梳子,保证点样孔完好，将凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至液面覆盖凝胶2-3mm，排出点样孔气泡（制备琼脂糖凝胶和进行电泳所用的电泳缓冲液必须一致）。

（二）点样

待测的DNA样品中加1/5体积的6x溴酚蓝指示剂，混匀后小心地进行点样，记录样品次序与点样量，点样量于点样孔大小匹配（如果DNA浓度较大，加的体积较小，就须加水或电泳缓冲液补足到规定体积，再加溴酚蓝指示剂混合均匀后点样），点样时枪头垂直，防止碰坏凝胶孔壁，带型不齐。

（三）电泳

1．打开电源开关，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。

根据需要设电压为1—5V/Cm，本实验选择5v，当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高，根据溴酚兰条带估计电泳位置；

2．电泳时间看实验的具体要求而异。

在电泳中途可用紫外灯直接观察，待DNA各条区带分开后，电泳结束。

一般当溴酚蓝条带移动到胶全长的2/3左右时,可停止电泳，取电泳凝胶直接拍照或绘图（每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准，进行对照电泳）。

实验四DNA片段的分离--从琼脂糖凝胶中分离DNA片段

通过本实验学习掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的工作原理及操作方法。

目前回收DNA片段的方法很多，常用的有冻融法，透析袋法，电泳回收法，玻璃孔回收法，本实验学习掌握低熔点琼脂糖法。

平时可根据实验的需要选择合适的方法进行DNA片段的回收。

PCR产物，电泳仪，电泳槽，天能凝胶成像系统，1%琼脂糖胶，50хTAEbuffer，刀片，Ω凝胶回收试剂盒

（一）从琼脂糖凝胶中分离DNA片段的操作步骤

将样品进行琼脂糖电泳，方法步骤见实验二，但注意下列不同：

1.先用去污粉清洗电泳槽、电泳制胶板和点样梳，清水冲净后，再用蒸馏水浸泡备用；

2.选择点样孔大小可供20-50微升（较检测点样孔大）左右的样品量点样（如无此长距离的点样孔，也可用透明胶封住2~3个点样孔）。

注：

尽量挑选比较薄点样梳制备回收用的琼脂糖凝胶，这样跑出来的DNA条带较窄，利于减少下一步切下来的琼脂糖凝胶块的体积。

3.按常规方法制备琼脂糖凝胶，但在凝胶制备过程中要保持环境中没有DNA污染；

不同大小的DNA片段要选择适合的琼脂糖凝胶浓度，在允许的情况下，琼脂糖凝胶的浓度越低越好。

4.点样时尽量避免样品的外泄，所以点样孔的体积要比样品体积稍大，如果同一块凝胶回收多个样品更要注意避免因点样过多而造成的样品彼此之间的污染。

5.用一只手拿住塑料板的一端，另一只手将电泳槽稍倾斜之，小心地把塑料板插入琼脂糖凝胶下面，把胶铲起放在长紫外灯上；

（二）低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法

1．戴好手套，准备好已灭菌的Eppendorf管子、医用眼科解剖刀与小电泳槽宽度一致的铲板一块，要把以上用具清洗后才可使用，防止酶的破坏作用；

2．在紫外灯下，用医用解剖刀在目的DNA片段的泳动方向正前方挖出一小块琼脂糖凝胶，挖块的大小与DNA样品量的多少有关；

DNA片段的回收一般在长波紫外下进行，因为紫外线对DNA的破坏随波长的增加而减少，但是本实验室只有混合波长的紫外灯，所以，在切胶的步骤上时间要尽量的短，以目的DNA片段的损伤。

3．在紫外等下用医用解剖刀尽量切除含DNA的凝胶，把含目的DNA区带的凝胶块放在Eppendorf管中；

4．大致估计凝胶块的体积，加5倍于凝胶块体积的20mMTris-HCl（pH8.0）、1mMEDTA缓冲液，将Eppendorf管子摇动数次。

5．把Eppendorf管子放在65℃水浴中，5~10分钟，使低熔点琼脂糖凝胶融化；

6．在室温（20℃）下用等体积的的酚与氯仿（1:

1）抽提一次，离心，吸出上层水相。

7．再用氯仿与异戊醇（24:

8．加3MNaAC至最终浓度为0.3M，再用二倍体积的无水乙醇沉淀DNA，置-20℃约1~2小时，12，000rpm离心10分钟，弃去乙醇；

9.75%乙醇洗涤沉淀后，离心，去乙醇，室稳烘干；

10.将DNA溶解在适量的无菌双蒸水中；

11.取0.5微升点样电泳，确定其浓度与纯度。

（三）各种柱回收法请严格按照试剂盒的说明书进行操作。

本实验采用Ω凝胶回收试剂盒，操作如下：

1.在紫外灯下将凝胶中的目的片段割下（不要在紫外线下暴露超过30秒），放入1.5mlEP管（预先称重）中，称量凝胶的重量。

2.加入等体积bindingbuffer（1g加1ml），在55℃－65℃孵育7分钟（2－3分钟晃一下，促进溶解）（溶液为桔红色就加5μl醋酸钠，浅黄色则不用）

3.10000g离心1分钟

4.将离心管中的液体转入柱子上，10000g离心1分钟，弃去废液

5.用300μlbindingbuffer洗柱，洗去非特异性吸附，10000g离心1分钟

6.用700μlSPWwashingbuffer，室温放置2－3分钟，10000g离心1分钟

7.重复步骤6

8.弃去收集管中的液体，重新放入柱子，10000g离心1分钟

9.把柱放入干净的1.5ml的离心管中，加入30μlElutionbuffer，室温放置2－3分钟，10000g离心1分钟，弃去柱子

10.把上步中的离心管－20℃保存（离心管中的得液体即为目的DNA溶液）。

a）从琼脂糖凝胶中回收DNA时，不容易做到彻底除净琼脂糖，这是因为琼脂糖是从琼脂中提取的，而琼脂中的琼脂胶含有硫酸根和羟基的多糖，因此绝大多数的琼脂糖中都带有含硫酸根的多糖，这种物质与DNA一起从凝胶中被抽提出来，它将强烈地抑制切酶、连接酶、激酶、聚合酶等活性。

此外，从琼脂糖凝胶中回收DNA的效率与DNA分子量的大小有关，当DNA分子量小于1kb时，可以绝大部分被回收，当DNA分子量大于20kb时，回收率一般低于20%。

b）在凝胶电泳中观察DNA区带时，为了避免DNA样品受到损伤，要用300~360nm长波长的紫外灯照射，尽量缩短照射时间，并使照射距离不能太近。

11.电泳检测回收到的目的DNA浓度。

实验五DNA的体外连接

通过本实验学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法，即将实验回收的目的片断与载体质粒片段进行定向连接的工作原理及操作方法。

在基因工程中，外源DNA片段和载体DNA的连接方法很多。

如果不利用专一性的限制酶切点，而利用某些酶对DNA能切出平整的末端，然后利用T4DNA连接酶将两者连接，这就是平头末端（Blutend）连接法。

但是它要求DNA的浓度高，连接酶的用量比粘性末端的连接大20~100倍，因此不普遍被利用。

采用粘性末端进行基因连接是最普遍，最方便的一种方法。

一般来说所采用的限制性切酶也以方法成熟，价格便宜的为好。

T4噬菌体DNA连接酶的作用：

在有ATP存在的连接缓冲系统中，催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。

DNA连接酶的作用步骤有：

1）T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物（腺苷酰酶）。

2）酶-AMP复合物再结合到具有5ˊ磷酸基和3ˊ-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。

3）产生一个新的磷酸二酯键，将缺口封起来。

以上连接反应的最适温度为37℃。

但是在这个温度下，粘性末端的氨键结合点是不稳定的。

一般限制性切酶作用所产生的末端，仅仅通过4-5个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的热运动。

因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其最适温度是采取催化反应与末端粘合这两者反应温度的折中。

一般采用16℃过夜（或者12℃）。

也有人采用7--8℃，连接2~3天。

本实验采用promega公司的pGEM-TTA克隆试剂盒，严格按照试剂盒的说明书进行操作。

pGEM®

-T和pGEM®

-TEasy载体系统可用于PCR产物的克隆。

这两种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM®

-5Zf（+）和pGEM®

-TEasy载体，并在3’末端加入胸腺嘧啶构建的。

插入位点3’-T突出端可提高PCR产物的连接效率，与DNA聚合酶在PCR产物末端加的A尾配对。

PCR胶回收产物，promega公司的PGEM-TTA克隆试剂盒，低温水循环水浴锅

1.确定好载体DNA和外源DNA的量，计算每微升DNA所含的摩尔数；

2.将载体DNA和外源DNA以摩尔数比约为1:

3的比例混合，补无菌双蒸水至9μl；

T载体的连接

①连接体系：

2×

buffer5μl

DNA3.5μl

T载体0.5μl

T4DNA连接酶1μl

Total10μl

3.弹匀，短暂离心；

4.置4℃水浴中,连接过夜（4~16小时）。

影响连接反应效率的因素

1.连接酶的用量：

在一般情况下，酶浓度高，反应速度快，产量也高。

但是当使用的连接酶单位下降时，要加入大量连接酶，而连接酶是保存在50%甘油中，因此在连接反应系统中由于甘油含量的过高，会影响连接效果。

如果连接酶的纯度欠佳，加进的连接酶到达一定浓度后，再增加酶量对加快反应速度并不明显，而杂酶（如降解酶）的作用变得明显，反而影响产率。

2.作用时间与温度：

反应时间是与温度有关的，因为反应速度随温度的提高而加快。

在我们实验中，根据试剂盒要求，采用4℃，但是在选择反应的温度与时间关系时，要考虑在反应系统中其他因素的影响。

3.底物的浓度问题：

一般采用提高DNA的浓度来增加重组的比例，但当底物浓度过高，反应体积太小（即浓度太大）时，连接效果也很差，这可能是分子运动受到阻挠。

4.干扰因素：

在酶切与连接反应中，除了要求有较高质量的纯酶以外，也要排除其他干扰因素，如EDTA的存在会抑制酶的活性。

DNA样品中有蛋白质、RNA存在，也会妨碍与DNA的直接作用，因而影响酶切与连接效果。

当酶切结束，为了去除加进去的切酶（蛋白质），以及在终止酶切反应时加进去的EDTA，都需要进一步提纯DNA样品。