hHSP70基因冠脉转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用Word格式文档下载.docx
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（3）冠脉转染4天后，再次暴露胸腔，在动脉圆锥与左心耳根部间结扎冠状动脉左前降支（LAD）。
结扎45min后,松开缝线使冠状动脉再通180min。
Ⅰ组只穿线不结扎。
Ⅲ组在LAD结扎5min后开放5min，并重复3次，然后再行45min缺血、180min再灌注。
（4）采用Evan'
sBlue和TTC双染色法后利用image-proplus5.0测定心肌梗死面积;
光学显微镜下观察心肌的炎症改变；
WesternBlotting免疫印迹测定心肌基因表达的改变并利用bandscan4.5进行灰度测量进而统计计算。
结果:
（1）经缺血预处理或hHSP70转染后的心梗范围（27.13±
2.7%，27.88±
5.3%，）较缺血再灌注组和腺病毒对照组（39.72±
4.2%，32.73±
7.0%）明显缩小。
hHSP70转染组与缺血预处理组没有统计学差别。
（2）hHSP70过量表达能够增加Bcl-2表达及减少caspase-3活化态的生成进。
（3）hHSP70过量表达能减少NF-κB的活化。
（4）心肌表达的蛋白发生相应的变化，hHSP70转染组hHSP70过量表达，，Bcl-2表达增加，活化的caspase-3减少。
结论：
（1）hHSP70转染能通过HSP70的过表达，增加Bcl-2表达，减少caspase-3的活化及其他机制来抑制凋亡。
（2）hHSP70转染能通过抑制NF-κB的表达及活化及其他机制起到抑制炎症作用。
（3）在HSP70过表达的情况下对心肌梗死与缺血预处理组没有统计学差别，可以起到与缺血预处理急性期同等程度的心肌的保护作用。
关键词缺血再灌注损伤，腺病毒载体，hHSP70，凋亡，炎症
ABSTRACT
Objectives：
ToobservetheprotectiveeffectagainstmyocardialischemiareperfusioninjuryaftertransferofhumanHSP70geneviacoronaryarteryandtoinvestigatethepotentialmechanisms.
Methods：
（1）Constructionofthereplication-deficientrecombinantadenovirus:
RecombinantplasmidsPDC-EGFP（containingenhancedgreenfluorescenceproteinEGFPgene）,PDC-hsp70（containinghumanHSPgene）.RecombinantadenovirusAdv-EGFP,Adv-hsp70wereproducedbyhomologousrecombinantin293cells,amplifiedalsoin293cellsonalargescale,andpurifiedbyultracentrifugationinCsClstepgradientsolutions.TheconcentrationofrecombinantadenovirusAdv-EGFPpurifiedbyultracentrifugationinCsClstepgradientsolutionsis2.0×
109Pfu/ml;
thatofAdv-hsp70is2.5×
1010Pfu/ml.
（2）50S-Dratswererandomlydividedinto5groups（n=10）.Theleftthoracotomywasperformedandthepericardiumopenedwiththeexposureoftheheartandthebaseofpulmonaryarteryandascendingaorta.Pulmonaryarteryandascendingaortawereoccludedbyapplyinganontraumaticvascularclamptoachievecompletecessationofoutflow,atthesametimeadenovirusparticles（1.0×
109pfu）in0.1mlof0.9%salinesolutionwereinjectedintotheleftventriclecavityusinga1-mlsyringewitha27-gaugeneedle.After10secondsofcompleteoutflowocclusion,theclampwasremoved.0.1mlsalinesolutionalonewasinjectedintotheratheartinGroupⅠⅡⅢ.InGroupⅣAdv-EGFPwasinjected.Allofthemwereclosedandrecovered,andthenstabilizedwithoutoperativeinterventionfor4day.
（3）After4days,arepeatthoracotomywasperformedtoexposetheanteriorsurfaceoftheheart.Theproximalleftanteriordescendingcoronaryartery（LAD）wasidentifiedanda6/0suture（Ethicon）wasplacedaroundthearterybelowtheleftatrialappendageandthesurroudingmyocardium.Regionalleftventricularischemiawasestablishedfor45minbyligationofLAD.Ischemiawasconfirmedbydiscolorationofmyocardiumandbychangesincardiacrhythm.Attheendoftheischemiaperiod,theligationwasloosenedandreperfusionwasachievedfor180min.GroupⅠ（sham-operatedgroup）servedassurgicalcontrolsandweresubjectedtothesamesurgicalproceduresasthetheexperimentalgroup,withtheexceptionthattheLADwasnotligated.GroupⅢweresubjectedtoischemicpreconditioning（IPC）beforeI/Rbyrepeatedischemiaandreperfusionthrough3cyclesofinducedLADischemiafor5minfollowedby5minofreperfusion.
（4）Toevaluatetheeffectof45minischemiafollowedby180minreperfusionoftheLAD,theareaatrisk（AAR）andinfarctregionweredeterminedbyEvan’sbluedyeperfusionandtriphenyltetrazoliumchloride（TTC）staining.Aliquotsofparaffinsectionwerehematoxylinandeosinstainedandexaminedunderthelightmicroscopetomeasurecardiacinflammation.DeterminationofBcl-2，activecaspase-3，activeNF-κBexpressioninheartwereperformedwithWesternBlottinganalysis.
Results:
（1）The%AAR,determinedbytheamountofnegativestainingregionwithEvan’sblueafterreligationoftheLAD,showednodifferenceamongLADligatedgroups（GoupⅡ~Ⅴ）.However,asignificantreductionofthe%infarctsizewasobservedintheHhsp70group（27.88±
5.3%）,andIPCgroup（27.13±
2.7%）comparedwitheithersalinecontrol（39.72±
4.2%）oradenoviralcontrol（adv-EGFP）（32.73±
7.0%）byTTCstainingintheregionalI/Rmodel.
（2）GenehHSP70overexpressioncanraiseBcl-2production、restraincaspase-3activated.
（3）GenehHSP70canrestrainNF-κBactive.
（4）Theexpressionofproteininratheartaltered.InAdv-HSP70grouptheheexpressionofHSP70andBcl-2wereraised,activatedcaspase-3decreased.
Conclusions：
（1）TransfectionofHSP70inhibitsinflammationthroughNF-κBdownregulation.
（2）TransfectionofHSP70suppressesapoptosisthroughincreasingBcl-2productionanddecreasingCaspase-3activation.
（3）TransfectionofHSP70demonstratessynergisticeffectsofmyocardialtolerancetoI/Rinjury,whichcananaloguetheprotectiveeffectofIPCtoalargerdegree.
KEYWORDS：
ischemiareperfusioninjury,adenovirusvector,hHSP70,apoptosis,inflammation
目录
中文摘要……………………………………………………………………………Ⅰ
英文摘要………………………………………………………………………Ⅲ
英文缩略……………………………………………………………………………4
前言………………………………………………………………………………5
第一章材料与方法………………………………………………………………9
1.1重组腺病毒构建…………………………………………………………9
1.2动物………………………………………………………………………15
1.3手术器械和仪器试剂……………………………………………………15
1.4方法………………………………………………………………………16
1.5统计处理…………………………………………………………………19
第二章结果………………………………………………………………………20
2.1重组腺病毒构建…………………………………………………………20
2.2各组心肌HSP70表达量检测……………………………………………22
2.3心肌梗死范围结果分析…………………………………………………23
2.4心肌缺血范围结果方差分析……………………………………………23
2.5HSP70转染对心肌的炎症作用……………………………………………24
2.5.1心肌的炎症光镜表现…………………………………………………24
2.5.2NF-κB结果分析………………………………………………………26
2.6细胞凋亡的结果分析……………………………………………………26
2.6.1HSP70对Bcl-2表达影响………………………………………………26
2.6.2HSP70对Caspase-3激活的影响………………………………………27
附图…………………………………………………………………………………28
第三章讨论………………………………………………………………………29
第四章结论………………………………………………………………………32
第五章参考文献…………………………………………………………………33
综述…………………………………………………………………………………36
致谢…………………………………………………………………………………48
主要英文缩略词表
Ad
Adenovirus
腺病毒
Adv
Adenoviralvector
腺病毒载体
Adv-EGFP
AdvencodingEGFP
腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因
Bcl-2
B-cellleukemia/lymphoma-2
B细胞淋巴瘤因子-2
EGFP
enhancedgreenfluorescenceprotein
增强型绿色荧光蛋白
CPB
cardiopulmonarybypass
心肺转流术
IPC
IschemicPreconditioning
缺血预处理
SOD
superoxidedismutase
超氧化物歧化酶
HGF
hepatocytegrowthfactor
肝细胞生长因子
HSP
heatshockprotein
热休克蛋白
IGF
insulin-likegrowthfactor
胰岛素样生长因子
IL-10
interleukin10
白细胞介素-10
I/R
Ischemiaandreperfusion
缺血再灌注
LUC
luciferase
荧光素酶
MLC
myosinlightchain
肌球蛋白轻链
mRNA
messengerribonucleicacid
信息核糖核酸
OFR
Oxygenfreeradical
氧自由基
AIF
Apoptosisinducingfactor
凋亡诱导因子
Pfu
plaqueformingunit
斑块形成单位
FGF
Fibroblastgrowthfactor
成纤维细胞生长因子
TNF
Tumornecrosisfactor
肿瘤坏死因子
TUNEL
TdT-mediateddUTPdigoxigeninnickendlabeling
原位缺口末端
标记技术
VEGF
vascularendothelialgrowthfactor
血管内皮细胞
生长因子
前言
缺血/再灌注损伤是指器官、组织在缺血的基础上恢复血液灌注时,细胞代谢功能障碍及结构破坏进一步加重的现象。
随着心脏骤停复苏成功率提高，动脉搭桥术、PTCA、心脏体外循环术的广泛开展，心肌的缺血/再灌注损伤的预防和治疗成为一个待进一步解决的课题。
防治心肌I/R损伤的有效办法除了尽快恢复心肌血流的再灌注外，控制炎症和抑制凋亡，就成为防治心肌I/R损伤的主要途径。
HSP70是应激条件下产生的主要应激蛋白。
HSP70对心肌再灌注损伤的保护作用是多方面的：
（1）抗炎症作用。
（2）抗凋亡作用。
（3）分子伴侣作用。
HSP70与炎症反应
HSP70的抗炎机制
（1）与其抑制核因子NF-κB的活性有关。
HSP70通过抑制NF-κB的核转运来调节促炎介质的表达，具体是通过抑制IκBkinase（IKK）起作用的
（2）。
NF-κB
核因子-κB（nuclearfactor-kappaB,NF-κB）是最早由Sen和Baltimore（3）从B淋巴细胞核提取物中发现的一种能与免疫球蛋白κ链基因增强子κB序列（GGGACTTTCC）特异结合的核蛋白因子。
NF-κB一般以异源二聚体形式（包括p50p65）存在于胞质中。
两亚基是由NF-κB阻遏蛋白IκB联结在一起的。
当受炎症刺激时，IκBkinase（IKK）磷酸化IκB。
NF-κB被释放进入胞核和DNA结合，引导多种炎症基因的表达。
NF-κB主要通过调控炎症介质基因的转录来控制炎症性疾病的发生及发展（4）。
多种体外实验证实，受NF-κB调控的炎症蛋白质包括细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6及粒-巨噬细胞集落刺激因子；
趋化因子如IL-8，调节激活正常T细胞表达和分泌的细胞因子，巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1α，巨噬细胞趋化蛋白（MCP）-1；
粘附分子（ICAM-1），血管细胞粘附分子（VCAM-1）；
受体如IL-2R,T细胞受体酶类如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等（5,6）。
NF-κB与心肌缺血再灌注损伤
研究证明NF-κB参与缺血再灌注损伤的病理生理过程。
Chandraseka等（7）凝胶电泳迁移率变化分析（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）测定缺血再灌注模型大鼠和对照组大鼠心肌的NF-κB的DNA结合活性，发现在非缺血心肌，只有低水平NF-κB的DNA结合活性;
而在实验组，在心肌缺血再灌注15min-3h，均出现NF-κB的DNA结合活性高峰。
Valen、Altavilla（8,9）等发现在离体大鼠模型中.心肌缺血后5min即有NF-κB的活性增高且持续30min。
在再灌注时，再灌注30min时NF-κB的DNA活性明显增加，在再灌注2h时达到最高峰。
IκB水平在缺血10min内胞浆内IκB明显降低，此后稍有恢复，缺血45min后又明显下降，而在再灌注1h后，达到最低点，之后又逐渐恢复。
提示NF-κB与IκB的相互作用。
Sun等（10）研究发现，NF-κB在缺血再灌注心肌内皮细胞的ICAM-1诱生中起重要作用。
Chandransekar等（11）发现NF-κB参与中性粒细胞在缺血再灌注心肌的激活，而中性粒细胞与血管内皮细胞结合是心脏缺血再灌注损伤的关键一步。
HSP70与细胞凋亡
I/R损伤与细胞凋亡
目前己有一些实验和临床研究发现，细胞凋亡可能是心肌缺血再灌注损伤发病机制的主要环节之一。
Chakrabarti等（12）在大鼠离体心脏灌注模型上发现心肌缺血10min即出现心肌细胞凋亡，缺血30min达高峰，证实了缺血可引起心肌细胞凋亡。
Fliss等（13）采用原位末端标记和琼脂糖凝胶电泳证实，缺血和缺血再灌注的大鼠有典型的凋亡形态学改变和DNA梯状电泳改变，即再灌注损伤可导致心肌细胞凋亡。
相关研究证明HSP70可以通过干扰caspase-3活性态的形成；
增加Bcl-2表达（14）；
抑制细胞色素C的释放等途径抑制细胞凋亡（15）。
caspase-3
诱发细胞凋亡的信号及其后的反应途径是多种多样的,但凋亡过程中都会发生蛋白质的特异性酶切。
属于半胱氨酸蛋白酶类的caspase酶家族就是执行特异性酶切的关键效应器酶,凋亡中许多生化与形态学改变都是caspase酶裂解底物的直接后果，caspase酶在细胞中以无活性的前体形式存在,向活性形式转化需要酶前体自体水解以产生包括活性酶在内的两个亚单位，按其基本结构可分为二类：
1型caspase酶（caspase-2,8,9,10）含有长的N端结构域,对细胞凋亡的启动很重要；
2型caspase酶（caspase-3,6,7）含有短的前结构域或缺失之,是介导特定底物水解作用的下游caspase酶（16）。
caspase酶的活化主要有两条途径：
线粒体途径和死亡受体途径（17）。
线粒体途径：
线粒体在外界应激等刺激下释放细胞色素C入胞液,在ATP/dATP存在的条件下与凋亡活化因子（Apaf-1）结合,提供能量诱导Apaf-1自身多聚化,形成8亚单位的Apaf-1多聚物,通过N端粘附caspase-9前体形成“apoptosome”复合物,其中caspase-9前体多聚化导致构象改变，自身裂解并活化,进而激活Caspase-3。
死亡受体途径：
含有死亡功能域（DD）的TNF-a家族成员先与配体结合,然后通过Fas死亡功能域相关蛋白（FADD）介导，结合caspase-8前体并与之形成死亡诱导信号转导复合物（DISC）进而激活caspase-8。
活化的caspase-9或
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