混饲恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响Word文档格式.docx
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分析纯AR，国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040628；
氯化氢溶液：
分析纯，上海东懿化学试剂公司，批号为20030910；
过氧化羟基异丙苯：
化学纯CP，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为T20040110；
盐酸苯胺：
分析纯AR，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为W20031020；
三氯乙酸：
分析纯，上海化学试剂采购供应站经销，批号为030114；
无水碳酸钠：
化学纯，山东博山试剂厂，批号为030508；
氢氧化钠：
分析纯，宜兴市第二化学试剂厂，批号为030401；
苯酚溶液：
分析纯AR，上海兴达试剂厂出品，批号为040301；
对-氨基酚：
化学纯CP，国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040816；
硫酸铜：
化学纯，合肥工业大学化工厂，批号为040214。
1.3主要仪器
FA1004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；
YP600型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；
TDL80—2B型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；
TGL—16C型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；
DY89—I型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研究所；
THZ—C恒温震荡器，太仓市光明分析仪器厂；
HH—S恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂；
BCD—502F型冰箱，青岛海尔冰箱股份有限公司；
721型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；
1.4药液的配制
蔗糖—Tris—Hcl缓冲液（PH7.4）称取蔗糖85.6g，三羟甲基氨基甲烷1.2g，溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至1000ml，放置于冰箱中保存备用。
Kcl-Tris-Hcl缓冲液（PH7.4）称取氯化钾11.2g，三羟甲基氨基甲烷1.21g，溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再，用蒸馏水定容至l00ml，放置于冰箱中保存备用。
氯化钙（Cacl2）溶液称取氯化钙5.0g，用蒸馏水定容至100ml。
0.1mol/L的Tris—Hcl缓冲液（PH7.4）称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加约80ml蒸馏水溶液，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至100ml，放置于冰箱中保存备用。
过氧化羟基异丙苯溶液称取过氧化羟基异丙苯0.65g，用蒸馏水定容至l00ml。
盐酸苯胺溶液称取1029g盐酸苯胺，用蒸馏水定容至l00ml。
70%三氯乙酸溶液称取三氯乙酸70g，用蒸馏水稀释至100ml。
碳酸钠溶液（Na2CO3）溶液称取10.6g，无水碳酸钠用蒸馏水溶解并稀释100ml。
氢氧化钠（NaOH）溶液称取氢氧化钠4g，用蒸馏水溶解并稀释200ml。
酚试剂量取苯酚溶液2ml，加NaOH溶液至100ml。
0.25mol.L-1对-氨基酚标准溶液精确称取27.28mg对-氨基酚，用少量的蒸馏溶解后转移入1000ml容量瓶中加水定容至1000ml。
2方法
2.1实验动物的分组和染毒方式
40只小鼠随机分为5组，公母各半；
各组的饲养管理条件相同。
实验期间细心观察各组小鼠的情况。
2.2样本的采集和处理
2.2.1小鼠肝微粒体的制备（钙沉淀法）
将小鼠停食24h后，颈椎脱臼处死，，迅速剖开腹腔取出肝脏，用预冷的生理盐水洗净血污，并用滤纸吸干表面的水分。
将肝脏称重后置于烧杯中，用手术直剪剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入蔗糖—Tris—Hcl缓冲液，用电动玻璃匀浆机匀浆，转速600r/min分，研磨上下移动8次。
将匀浆倒入量筒，用缓冲液洗涤匀浆管并将其倒入量筒中，最后缓冲液的体积加至约5ml/g组织。
将肝匀浆转移到离心管中，以600r/min平衡离心5min，弃取沉淀部分（细胞碎片和细胞核），上清液以12000r/min离心10min，弃取沉淀部分（线粒体）。
量取去除线粒体的上清液的总体积，加入Cacl2溶液2ml，以14000r/min离心15min，弃取上清液，沉淀部分即为粉红色，半透明的微粒体。
将微粒体沉淀，混悬于Kcl-Tris-Hcl缓冲液中，并用玻璃匀浆器充分混均匀，再经14000r/min离心15min，其沉淀即为经清洗的微粒体。
最后将制备所获得微粒体悬混于Kcl-Tris-Hcl缓冲液（缓冲液用量约为1ml/g组织）中，用玻璃匀浆器充分混均匀，并分装后放置于冰箱中保存。
使用前按双缩脲法测定微粒体蛋白的含量。
2.2.2微粒体蛋白含量的测定（双缩脲法）[8]
取6只试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准酪蛋白质溶液，再分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0毫升蒸馏水，然后加入1.0毫升双缩脲试剂在室温放置30min，于540毫微米波长下比色，最后光密度以Y表示，酪蛋白的含量以X表示，计算出曲线的回归方程一。
吸取1毫升微粒体混悬液，加入1.0毫升的蒸馏水和4.0毫升双缩脲试剂，与前同样比色，根据吸光度和回归方程一求出微粒体混悬液蛋白的含量。
2.2.3苯胺羟化酶的活力的测定[9.10]
取清洁干燥的试管按表1加入试剂,将上述各试管置于37℃水浴预温3min后，按顺序每管加入过氧化羟基异丙苯0.1ml，继续水浴震荡3min，按顺序每管加入三氯乙酸溶液0.3ml，微粒体悬混液0.5ml。
经2000r/min离心10min后，分别将各管的全部上清液取于另一试管中，加入1ml酚试剂，室温下反应30min。
以1号试管作参比，在630nm处比色测定，以吸光度为Y，对-氨基酚的含量为X，算出回归方程二。
表1标准液的配制
试管编号
缓冲液（ml）
对-氨基酚标准液（ml）
相当于对-氨基酚（nmol）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.7
0.5
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.8
25
50
75
100
125
150
200
250
取清洁干燥的试管按表2加入试剂：
表2：
样品测定液的配制
空白对照管（ml）
样品测定管（ml）
微粒体
缓冲液
苯胺溶液
蒸馏水
—
以下的操作除不再加微粒体外，其余步骤与标准曲线操作相同。
以空白管作为参比，测样品管测的光密度值，依据回归方程二求出对应的对-氨基酚含量（nmol），并按下式计算苯胺羟化酶的活力。
苯胺羟化酶的活力（nmol/mg.min）=生成的对-氨基酚含量（nmol）/微粒体蛋白浓度（mg/ml）×
0.5×
2.3统计方法
用SPSS11.0forwindows软件对试验数据的进行统计分析,试验数据以（
）表示,确定差异显著性作t检验,以P<
0·
05为差异具有统计学意义。
3结果与分析
3.1回归方程一
根据表3所测的数据计算出回归方程一为Y=0.065+1.76X,r=0.9908根据回归方程一计算出的蛋白质的含量,见附录。
根据表4的数据[14]求出的回归方程二:
Y=0.021+2.858×
10–3X,r=0.9802根据回归方程二计算出对-氨基酚的含量，见附录。
根据公式：
苯胺羟化酶活力（nmol/mg.min）=生成对氨基酚的含量/微粒体蛋白浓度，计算出苯胺羟化酶活力见表5。
表3：
标准蛋白质溶液的吸光度
相当于蛋白质（mg/ml）
吸光度
10
0.057
0.195
0.266
0.470
0.557
3.2回归方程二
表4：
标准液的吸光度
0.069
0.159
0.198
0.302
0.424
0.530
0.594
0.681
表5恩诺沙星对苯胺羟化酶活力影响（
，n=5）
组别
染毒剂量
苯胺羟化酶的活力
（nmol/mg.min）
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
50mg/kg
100mg/kg
150mg/kg
200mg/kg
419.404±
198.971
190.459±
47.406
131.827±
53.320
82.260±
19.259
32.196±
10.705
注：
与对照组比较，**p<
0.01*p<
0.05
对照组Ⅰ苯胺羟化酶的活力419.404±
198.97nmol/（mg.min），实验组Ⅱ苯胺羌化酶的活力为190.459±
47.406nmol/（mg.min），实验组Ⅲ苯胺羌化酶的活力为131.827±
53.320nmol/（mg.min），实验组Ⅳ苯胺羌化酶的活力为82.260±
19.259nmol/（mg.min），实验组Ⅴ苯胺羌化酶的活力为32.196±
10.705nmol/（mg.min），与对照组相比，四个实验组差异都极显著（P﹤0.01），并且随着偏钒酸铵剂量的增加苯胺羟化酶的活力逐渐下降,而实验组之间相对比实验组Ⅱ与实验组Ⅴ差异极显著,实验组Ⅱ与实验组Ⅳ差异显著，实验组Ⅲ与Ⅴ之间差异显著（P﹤0.05），Ⅱ与Ⅲ，Ⅲ与Ⅳ，Ⅳ与Ⅴ之间不显著（P＞0.05）。
4讨论
在微粒体苯胺羟化酶的催化下，苯胺可以被代谢生成对-氨基酚，在碱性条件下，对-氨基酚可与苯酚形成蓝色靛酚复合物，并在630nm波长处显示最大吸收峰值。
因此，本实验采用代谢产生的对-氨基酚量来间接判定苯胺羟化酶的活力[9]。
外源性化合物在机体内代谢，需要许多酶的参与，代谢外源性化合物的酶系主要是肝微粒体酶，其中最主要的为混合功能氧化酶系。
混合功能氧化酶系中有一种肝微粒体酶羟基化系统，这种酶系统催化一些外来化合物发生羟基化，从而发生代谢活化，使其作用增强，或者羟基化后其水溶性提高，易于排除体外，作用降低。
而苯胺羟化酶是肝微粒体羟基化系统的一种酶，它催化苯胺发生羟基化生成对-氨基酚[11]。
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表6：
样本吸光度和蛋白质的含量
样本号
蛋白质含量（mg/ml）
Ⅰ-1
Ⅰ-2
Ⅰ-3
Ⅰ-4
Ⅰ-5
Ⅰ-6
Ⅰ-7
Ⅰ-8
0.252
0.261
0.287
0.308
0.267
0.323
0.300
0.336
0.106
0.111
0.126
0.138
0.115
0.147
0.134
0.154
Ⅱ-1
Ⅱ-2
Ⅱ-3
Ⅱ-4
Ⅱ-5
Ⅱ-6
Ⅱ-7
Ⅱ-8
0.344
0.360
0.294
0.327
0.355
0.324
0.351
0.311
0.168
0.130
0.149
0.165
0.157
0.163
0.140
Ⅲ-1
Ⅲ-2
Ⅲ-3
Ⅲ-4
Ⅲ-5
Ⅲ-6
Ⅲ-7
Ⅲ-8
0.370
0.384
0.397
0.353
0.416
0.480
0.466
0.434
0.173
0.181
0.189
0.164
0.199
0.236
0.228
0.210
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
0.467
0.433
0.400
0.436
0.459
0.442
0.409
0.499
0.440
0.461
0.492
0.638
0.491
0.453
0.552
0.230
0.190
0.211
0.224
0.214
0.204
0.247
0.213
0.225
0.243
0.326
0.242
0.220
0.277
Ⅴ-1
Ⅴ-2
Ⅴ-3
Ⅴ-4
Ⅴ-5
Ⅴ-6
Ⅴ-7
Ⅴ-8
表7：
样本的吸光度和对-氨基酚的含量
对照组吸光度
样品检测组吸光度
对-氨基酚含量（nmol）
0.047
0.105
0.062
0.089
0.038
0.029
0.076
0.176
0.121
0.087
0.064
0.114
29.741
54.234
32.890
34.990
23.093
15.054
58.782
32.540
0.040
0.048
0.036
0.032
0.76
0.054
0.058
0.067
0.071
0.104
0.088
0.084
0.078
12.946
16.095
17.495
15.045
29.041
23.442
22.043
19.944
0.051
0.46
0.041
0.034
0.037
0.027
0.083
0.101
0.049
19.244
21.693
27.992
12.596
16.795
12.596
14.346
9.797
0.023
0.035
0.024
0.039
0.046
0.061
0.053
0.052
8.747
10.497
12.946
13.996
11.197
6.998
10.847
11.547
0.017
0.022
0.015
0.019
0.020
0.033
0.028
4.199
4.549
5.248
5.948
2.449
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