如何区分凋亡细胞与坏死细胞.docx

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如何区分凋亡细胞与坏死细胞

细胞凋亡（Apoptosis） 是生物界广泛存在的一种现象,与其它的生命现象一样具有同等重要的生理学或病理学意义。

尽管其最终结果也是导致细胞死亡,但其诱导因素、发生机制和过程及意义均明显不同于一般的病理性细胞死亡（即细胞坏死性死亡,简称细胞死亡） 。

细胞凋亡的形态特征与细胞坏死性死亡的形态特征不同。

细胞坏死性死亡是被动的病理性死亡,其形态特征首先是膜通透性增加,细胞外型发生不规则变化,内质网扩张,核染色质不规则移位,进而线粒体及核肿张,溶酶体破坏,细胞膜破裂,胞浆外溢,这种死亡 过程常常引起炎症反应。

细胞凋亡则是在某些因素的诱导下,由细胞内在的有规律的机制引起的,是主动的生理性细胞自杀。

其特征是细胞首先变圆,随即与邻近细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,线粒体无明显变化,核染色质浓缩成块并凝聚在核膜周边,胞膜内陷将细胞自行分割为多个有外膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体,后被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬。

由于细胞凋亡过程不导致溶酶体破坏及胞膜破裂,没有细胞内容物外泄,故不引起炎症反应,在生理条件下,生物体内细胞存活与死亡是由自身发育阶段提供的遗传信息,或由邻近细胞和其微环境提供的信号决定的,其中包括细胞相互接触提供的信号以及周围环境中活性物质、激素等。

这些刺激信号的增加或减少调节着细胞产生和凋亡,维系着机体细胞的有序状态

细胞凋亡的检测细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。

细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人细胞凋亡形态学检测方法。

细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。

目前对细胞凋亡的认识不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。

光学显微镜观察

凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。

在HE染色的组织切片中细胞积缩小.胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。

在组织中凋亡细胞以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。

检测方法：

细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微镜测量工具可作凋亡计数。

本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。

本方法.可用于凋亡现象的初步观察，作为分析指标之一。

视频时差显微技术（videotime-lapsemicroscopy）

本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。

凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，持续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可检测培养基中凋亡细胞，但不能用于病理组织。

检测方法：

收集2x105细胞/ml培养，置于多空培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔30秒作序列摄影，连续24小时。

如同时进行荧光染色，可参荧光显微镜下观察和摄影。

电子显微镜观察

凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月板或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳体现。

为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。

本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。

由于样品范围局限，在凋亡数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。

检查方法：

透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸橼酸电子重染色，透射电镜观察。

扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

一、检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法

磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）

原理：

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。

Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法1悬浮细胞的染色：

将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

　　2贴壁培养的细胞染色：

先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

　　3爬片细胞染色：

同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

应用价值：

细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。

又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。

因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

结果：

细胞内氧化还原状态改变的检测：

细胞色素C的定位检测 

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。

正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后启动caspase级联反应：

细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

 细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：

COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

方法：

 ApoAlertTMCellFractionationKit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。

三、线粒体膜势能的检测

原理：

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester（TMRM）等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

方法：

将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。

结果判定：

经LPS刺激后的细胞，绿色荧光强度增加，意味着膜电位下降，细胞发生凋亡。

意义：

该法通过对细胞生理指标的监测检测来反映细胞凋亡，结果直观、灵敏

四、DNA片断化检测

、DNA凝胶电泳

（一）、检测原理

细胞凋亡过程中,可发生特异性级联生化反应,其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活.此酶可作用于连接DNA的核小体间区域,DNA链被切割成180~200bp或其整倍数的片断.抽提DNA,经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱。

而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

方法：

1,DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡细胞2,获取凋亡细胞3,抽提DNA4,琼脂糖凝胶电泳5,紫外灯下观察结果

（二）结果判断

正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

用途：

此方法灵敏性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。

凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

原理：

由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

方法：

收集细胞?

70%冷乙醇（inPBS）4°C固定过夜?

PBS洗涤，1000rpm′10min?

RNaseA（0.5mg/ml）37°C消化30min?

PI（50mg/ml）染色，室温避光15min?

FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

优点：

敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。

如临床活组织检测。

三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定

原理：

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。

核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体；3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合‘4、加酶的底物，测光吸收制。

用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。

可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。

该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

五TUNEL法

原理：

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

方法：

石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。

凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP显色）或棕黄色（DAB显色）。

用途：

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体