合成生物学在细胞治疗中的临床应用Word下载.docx

合成生物学在细胞治疗中的临床应用Word下载.docx

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在一项II期临床试验中，Salmonellatyphimurium（S.typhimurium）与化疗药物联用可以用于治疗胰腺癌。

为了增强细菌治疗的肿瘤靶向性，在细菌上表达了肿瘤特异抗原或者肿瘤特异抗体，可以实现肿瘤抗原依赖的细菌富集（图1a）。

图1a 

肿瘤的细菌治疗

细菌还可以递送多种抗癌分子，并且使用肿瘤环境特异启动子来驱动抗癌基因表达，能够实现响应肿瘤微环境释放抗癌分子。

常用的抗癌分子包括前药酶、siRNA等。

I期临床试验（NCT01562626）正在评价表达胞嘧啶脱氨酶的Bifidobacterium对实体瘤的治疗效果。

胞嘧啶脱氨酶用于将前药flucytosine转化为抗肿瘤药5-fluorouracil。

为了在肿瘤组织调控工程细菌，多种传感器被构建到细菌中，可以响应多种调控信号，如细菌密度、低氧水平和低葡萄糖浓度等。

例如，S.typhimurium经过工程改造后可以响应低氧环境表达溶菌蛋白HlyE。

诱导型细菌自溶系统则可以同时实现可控的抗癌分子递送和细菌种群数量的稳定。

诱导型自溶Escherichiacoli（E.coli）细菌群体感应（quorumsensing）分子acyl-homoserinelactone（AHL），当AHL处于低水平时，细菌增殖并在胞内产生抗癌分子，随着细菌数量增加，AHL不断积累并超过阈值，会导致细菌裂解而释放抗癌分子。

二、其他疾病的细菌治疗

细菌治疗还用于治疗肠道菌群紊乱，代谢疾病和炎症反应疾病。

E.coliNissle1917和Lactobacillus等本身是益生菌，而且容易进行工程改造，可以作为细菌治疗中良好的底盘细菌。

高血氨症是由于尿素循环中酶缺陷导致的血液氨堆积。

E.coliNissle1917被改造可以同化氨并合成精氨酸，降低血液氨浓度，但该方法未能通过I期临床试验。

苯丙酮尿症是一种无法代谢苯丙氨酸的代谢疾病。

通过在E.coliNissle1917中表达氨基酸脱氨酶，可以将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸从而减少氨基酸的堆积，该研究目前已顺利通过临床I期试验（图1b）。

图1b 

细菌治疗代谢疾病

E.coliNissle1917经改造表达抗菌肽和biofilm降解酶，用于治疗铜绿假单胞菌感染（图1c）。

图1c细菌治疗病原体感染

肠道细菌和噬菌体还被改造用于向病原菌递送基因编辑元件，以减少病原菌的抗药性和毒力基因的表达（图1d）。

工程化细菌还被用于控制哺乳动物细胞的基因表达。

例如，含有siRNA质粒的细菌可以侵入并将质粒递送到肠道粘膜细胞，用于降低细胞炎性酶COX2的表达。

图1d 

细菌提送基因

目前已有多个细菌治疗系统处于临床试验阶段（表1），但是细菌的工程化改造也面临挑战。

首先，为细菌设计合适的信号调控开关并不容易，细菌难以响应合适的信号阈值并产生适当浓度的效应分子，这影响了细菌疗法的治疗效果。

其次，细菌治疗存在生物安全性风险，欧盟和美国的药监部门对工程菌的基因组稳定性、细菌在体内的定植时间和在体内是否能够被清除等问题都要求提供大量证明。

为了提高细菌治疗的生物安全性，有一系列措施用于细菌的改造，例如移除工程细菌的毒力基因来减少细菌毒性，使用营养缺陷型细菌或者引入自杀基因在必要时可以清除体内工程菌。

表1近期细胞治疗的临床试验

三、改造免疫细胞的细胞治疗

合成生物学在T细胞治疗领域已经获得了巨大成功。

为模拟天然T细胞的细胞杀伤作用，合成的Tcellreceptor（TCR）-T细胞治疗是将识别肿瘤抗原肽的TCR构建到杀伤性T细胞上。

TCR不但可以结合膜表面抗原，还可以结合胞内抗原，因此可以针对广泛的靶点。

TCR-T细胞治疗在临床试验中取得了积极的治疗效果。

但是TCR只能识别抗原肽-MHC分子复合物，而MHC分子在人群中具有多态性，这限制了TCR-T细胞治疗的应用。

为了摆脱MHC分子的限制，人工构建了嵌合受体chimericantigenreceptor（CAR），CAR受体是将scFv与TCR的信号转导区域融合的人工受体，可以不依赖MHC分子识别肿瘤抗原。

第一代CAR受体只含有一个胞内信号结构域；

第二代和第三代CAR受体包含一个或两个共刺激信号结构域，可以提高T细胞的增殖和细胞因子分泌，是目前已经被批准的CART细胞所采用的受体；

第四代CART细胞在上一代基础上增加了响应CAR信号的下游效应基因如细胞因子，可以提高T细胞在体内的存活时间（图2a）。

图2ACART细胞治疗的设计

尽管CART细胞在血液肿瘤的临床治疗中取得了成功，但是针对实体瘤，还不能实现安全和有效性的治疗。

近年来，科学家已经利用合成生物学原理对CART细胞做了诸多改进。

在提高安全性方面，以caspase9或者herpessimplexvirusthymidinekinase（HSV-TK） 

作为自杀基因，利用小分子诱导二聚等原理激活自杀基因作用，可以在需要时清除CART细胞（图2Ba）。

图2Ba 

携带自杀基因的CART细胞

另外，为CART细胞构建额外的抑制性iCAR受体可以减少对健康细胞的攻击，抑制性iCAR是将T细胞抑制性受体CTLA4或PD1的胞内区与识别健康细胞抗原的scFv融合，CART细胞可以利用抑制性iCAR受体识别健康细胞而不会产生杀伤激活信号，利用杀伤性CAR受体识别肿瘤抗原（图2Bb）。

图2Bb 

抑制性CART细胞

减弱CART细胞的功能活性也是一种提高安全性的策略，利用小分子诱导的CAR蛋白降解可以调节细胞表面的CAR受体表达水平，能够实现对CART细胞活性的可逆调节（图2Bc）。

图2Bc 

CAR受体表达水平的调节

在提高有效性方面，SynNotch-gatedCAR可以实现“AND”逻辑门控制杀伤，即只有两种肿瘤抗原同时存在时才能激活肿瘤杀伤作用。

聚体原理时，第一个肿瘤抗原结合T细胞的SynNotch受体后导致受体的转录因子结构域从受体上被切割并进入细胞核，启动CAR受体的表达，CAR受体可以识别第二个肿瘤抗原产生肿瘤杀伤效应（图2Bd）。

图2Bd 

SynNotch-gated 

CART细胞

AvidCART细胞是用低亲和力的单域抗体替代高亲和力的scFv构建CAR受体，这使得AvidCART细胞必须依赖两个CAR与肿瘤抗原结合才能激活下游信号通路，提高了对肿瘤抗原表达水平的区分度（图2Be）。

图2Be 

AvidCART细胞

Split,universalandprogrammable（SUPRA）CARs是一种通用的CAR受体，由TCR胞内区和胞外leucinezipper组成，SUPRACART细胞发挥功能需要依赖向内体注射适配蛋白，适配蛋白一端为识别肿瘤抗原的scFv，另一端为互补的leucinezipper结构域，SUPRACART细胞可以根据不同的adaptor蛋白来识别不同的肿瘤抗原（图2Bf），在肿瘤治疗的不同阶段，杀伤表达不同肿瘤抗原的肿瘤细胞，可以有效防止肿瘤细胞逃逸。

图2Bf 

SUPRACART细胞

除了用于CART细胞治疗外，CAR受体还被应用于其他免疫细胞。

NK细胞是固有免疫细胞，可以通过受体介导细胞杀伤。

装载了识别肿瘤抗原受体的CAR-NK细胞在临床I期和II期试验中都显示出了良好的治疗效果（图3a）。

而且CARNK细胞可以使用来源于HLA不配对的异体NK细胞进行CAR受体的表达，临床试验结果表明异体来源的NK细胞在病人体内有良好的免疫耐受，但是目前异体NK细胞免疫耐受的机制还不清楚。

图3a 

CARNK细胞

在肿瘤微环境中，有两种功能相反的巨噬细胞，M1巨噬细胞具有抗肿瘤活性，而M2巨噬细胞可以促进肿瘤生长。

研究表明，CAR-巨噬细胞可以浸润实体瘤，通过释放细胞因子调节免疫，不但可以维持M1巨噬细胞的稳定，还能将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，缩小肿瘤体积（图3b）。

图3b 

CAR巨噬细胞

调节性T细胞通过分泌细胞因子来抑制免疫，构建CAR-调节性T细胞可以产生抗原依赖的免疫抑制效应，已经在临床试验中用于自身免疫疾病的治疗（图3c）。

图3c 

CAR调节性T细胞

-04-

改造其他哺乳细胞的细胞治疗

除了免疫细胞外，合成生物学还被用于改造其他类型哺乳动物细胞作为细胞治疗工具。

尽管这些工程化细胞还没有进入临床试验，但在多种疾病模型动物实验中已显示出良好的治疗效果。

例如，在HEK293细胞上构建细胞因子的信号通路，可以识别组织中的促炎细胞因子，释放拮抗剂来减少炎症反应，治疗自身免疫疾病（图4a）。

图4a 

治疗自身免疫疾病的真核细胞

间充质干细胞是再生医学研究中的重要工具。

为间充质干细胞过表达IL-1受体拮抗剂可以降低免疫反应，同时过表达VEGF可以促进血管生成，则用于促进组织再生（图4b）。

图4b 

间充质干细胞的改造

合成生物学已经对细胞治疗领域产生了重要影响，未来随着在越来越多的合成生物学工具的开发，细胞治疗将有望用于治疗更广泛的疾病。