生殖器疱疹有哪些症状表现Word文件下载.docx

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（一）用PCR分型检测单纯疱疹病毒

PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，标本中含有1fgHSV-DNA就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。

1，标本采集和处理

（1）标本采集

①脑脊液：

直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色，应离心取上清。

②羊水及婴儿血清:

同上，应避免溶血.

③脑组织:

脑组织尸检，活检标本，加1mlPBS标本缓冲液研磨后，待检。

④眼及皮肤病灶分泌物：

用预测（半干）棉拭子直接取患处分泌物，置1mlPBS标本缓冲液中送检。

⑤生殖器（宫颈，阴道，外阴，阴茎）标本：

先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液，污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1mlPBS标本缓冲液中送检。

（2）标本处理

①预处理：

所有液体标本均可直接进行模板制备;

可以取100μl标本液，离心5000r/min×

5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。

②模板制备：

a:

蛋白酶K消化裂解法：

沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10min，离心5000r/min×

5min，收集上清，b:

水煮法：

沉淀物加100μl蒸馏水，摇均水煮20min，离心5000r/min×

5min收集上清，c:

1%TritonX-100裂解法:

取采集的标本液100μl，加入1μlTritonX-100，水煮20min，5000r/min×

5min，收集上清，d:

5%NP-40裂解法：

取采集的标本液100μl，加5μlNP-40，水煮20min，5000r/min×

5min收集上清，e:

如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-氯仿抽提，冷乙醇沉淀DNA，加10μlDW溶解待检。

2，PCR扩增

（1）引物设计，以HSVDNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性，设计3个引物，一个上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：

二个下游特异性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分别扩增出HSV-1469bpDNA片段（1981～2359），HSV-2391bp片段（1561～1953）：

从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP35‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG3‘）。

（2）PCR实验体系，取模板10μl：

DNAP50.5（0.2μmol/L）：

DNAP3-10.5μl（0.2μmol/L）：

DNAP3-20.5μl（0.2μmol/L）：

4×

dNTP8μl（4×

200μmol/L）：

10×

200μmol/L）;

缓冲液10μl：

DMSO4μl;

加DW65.5μl;

石蜡油30μl.。

水煮（96℃～100℃）7min

加TaqDNA聚合酶1μl;

（2.5U）

72℃4min

↓

95℃40s

，

65℃60s→72℃70s

↓33个循环

70℃4min

3.扩增产物的检测和分析

（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：

取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙锭（EB）染色5min，于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

（2））XhoI酶谱法：

取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%琼脂糖凝胶中，70V电泳15～20min，可产生46bp片段带（引物后面）;

与正常PCR产物比较，XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。

（3）Southern印迹法：

PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上：

80℃烤膜2h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32p标记HSVP3探针后，42℃杂交过夜;

次日用1%SDS/PBSpH7.2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2，42℃洗15min;

膜置X线暗盒内放射性自显影12～15h，显影为阳性，不显影为阴性。

（二）套式PCR

套式PCR（nestedprimers-polymerasechainreaction，NP-PCR）是通过“外侧”，“内侧”两对引物，即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物，这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性，但该方法不能分型，能100%检出HSV-1，50%检出HSV-2，应改进分型检测HSV，更好地在临床应用和基础研究中推广应用。

1，标本处理：

（1）标本采集同上

（2）DNA制备：

取100μlCSF水煮15min，加入250μl无水乙醇，放-30℃10min;

离心10000g30min，去上清，30℃干燥后，加入10μlDW;

②脑组织细胞：

取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min;

取上清加入等体积酚一氯仿（V/V），轻摇10min，离心10000r/min×

10min;

取水相，加入250μlDW溶解。

（1）引物设计：

选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。

NP-PCR的引物和探针序列

“外”引物

BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43

BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239

“内引物”

BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79

BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188

探针

BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125

（2）PCR实验体系和程序:

反应体积为50μl;

模板10μl;

BJHSV1.10.5μl（0.2pmol/L）;

BJHSV1.20.5μl（0.2pmol/L）;

10×

缓冲液5μl;

4×

dNTP4μl（4×

200mmol/L）;

DW27μl;

石蜡油30μl，循环参数为95℃30s;

55℃30s;

72℃60s;

循环20次，取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增，先95℃变性2min，循环参数为95℃30s;

循环30次后，72℃延伸5min;

。

（3）扩增产物分析：

①琼脂糖凝胶电泳染色法：

取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中，70V电泳15-20min，溴化乙锭染色5min，于紫外灯下观察结果，在溴酚兰后面有一条，或二条亮红条带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

②Southern印迹法：

PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32P标记HSV探针后，42℃杂交过夜，次日用1%SDS/PBSpH7，2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2，42℃洗15min;

膜置X线暗盒内，放射性自显影12-15h，，显影为阳性，不显影为阴性。

（三），聚合酶链反应―酶谱法（polymerasechainreaction-endonucleasecleavagePCR-EC）

具有经济广泛等特点;

不仅能一次性分型检测HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四种病毒，而且方法本身快速，方便，无放射线损伤，易被实验室接受，可检出3个CFU的HSV1，灵敏度高，能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSVDNA阳性结果，并可用于药物治疗效果的评价，由于病毒的变异性，会出现酶切点突变丢失现象，从而造成酶切阴性结果，对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。

1.标本处理

（1）标本采集，方法同上。

（2）DNA模板制备：

每份标本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h;

加入等体积的酚―氯仿（v/v）轻摇10min，离心1000r/min×

5min;

取水相加入500μl（2.5倍体积）无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA，离心15000r/min×

5min，吸去液体，30℃干燥后，加蒸馏水25μl溶解，待检。

2.引物设计：

P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

（1）PCR实验体系：

反应体积100μl;

模板10μl;

P10.5μl（10pmol/L），P20.5μl（10pmol/L）;

缓冲液10μl，DMSD5μl，DW65μl，循环参数为94℃60s;

60℃60s;

循环40次72℃延伸4min。

（2）扩增产物检测与酶切分型.

①第一步电泳鉴定:

取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液，加入2%琼脂糖凝胶板，70V电泳（5-20min）加EB染色5min后，紫外灯下观察，可初步鉴定扩增产物大小。

②酶切分析：

分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中，加入50μl无水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解，加入SmaI或BamHI50U于相应Eppendorf管内，37℃作用1h。

③第二步电泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液，加到2%琼脂糖凝胶中，70V电泳，15-20min后，EB染色5min，与同步加入未酶切的PCR产物相对照，紫外灯下观察，结果如下:

PCR-EC法检测四种病毒结果

病毒型号靶片段SmaIBamHI

HSV1518bp476bp+42bp

HSV2518bp―225+293bp

EBV524bp100bp+424bp277bp+247bp

CMV589bp不需酶切，第一步电泳就可以区分

（四）用RT-PCR检测单纯疱疹病毒

RNA的聚合酶链反应（RNA-PCR），可能通过检测HSV不同期的RNA，这不仅可诊断HSV感染，而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。

RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应（RT）产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的，因此，RNA-PCR也可称为RT-PCR。

组织块细胞总RNA提取，取100mg组织标本，加1ml硫氰酸胍变性液，于匀浆器中，室温研磨均匀后，移入2.5mlEppendorf管中，依次加入0.1ml3mol/L（pH4.0）NaAc，1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀，用力振摇10s，置冰浴15min，10000g4℃，离心20min，取上清水相（上层DNA，下层DNA和变性蛋白质）加入等体积异丙醇置-20℃1h，沉淀RNA，离心15000r/min×

10min，弃上清，RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解，再加0.3ml异丙醇沉淀，-20℃1h，沉淀RNA.离心15000r/min×

10min，去上清，沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次，真空干燥，.加10μlTE缓冲液（pH7.4）溶解，低温保存备用.临用前冰浴溶解。

2，PCR扩增:

（1）引物设计:

选择HSV-1ICPO基因（极早期）为检测靶基因.设计2个引物。

P15′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT3′

P25′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG3′可以扩增ICPO中266bp序列。

1个探针：

5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

（2）PCR实验体系：

总反应体积为50μl，模板10μl（0.25-1.0μg）P11μl（20pmol/L）;

P21μl（20pmol/L）;

dNTP4μl（200μmol/L）;

AMV（逆转录酶）2μl（50U）;

DW26μl;

循环参数，94℃变性2min后94℃50s，60℃60，72℃60s，循环40次后72℃延伸5min。

3，扩增产物的鉴定：

取10μlPCR扩增产物加4μl样品缓冲液，混匀后加样2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15-20min，EB染色5min，紫外灯下观察扩增条带。

（2）Southern印迹杂交法：

用32P标记的特异性探针检测PCR产物，方法同上。

总之，在HSV感染性疾病的临床诊断中，PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测，远较DNA探针敏感，并能在血清中抗体出现前就可以检出，因此，PCR无论是作为基础研究手段，还是作为临床检验诊断方法，均具有广阔的前景。

五，病理组织学诊断

细胞内水肿，基底层形成大水疱，病灶周围有多核巨细胞浸润，特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间。

1.原发性GH

（1）潜伏期：

为2～7天，常为3～5天。

（2）好发部位：

男性多发生于龟头，冠状沟，尿道口，阴茎体及阴囊，女性好发于外阴，阴道及宫颈，两性均可见于肛周，大腿及臀部。

（3）皮损形态及演变：

患处先有烧灼感，随即出现多个群集的红色斑丘疹，并迅速变成小水疱，疱液起初清亮，以后渐变为脓性，水疱易破溃，形成糜烂或浅溃疡，伴明显疼痛，之后结痂而愈，病程约2～4周。

（4）全身症状：

发病前或发病时可有全身症状，如发热，头痛，全身不适，颈项强直和骶2～4段感觉异常，或有排尿困难和白带增多，几乎所有患者均可伴腹股沟淋巴结肿大及压痛。

2.复发性GH

约在原发性GH痊愈后1～4个月发生，首次HSV-2感染后1年内近60%的患者复发，第1年内可复发4～6次，以后复发次数减少，eves等发现在生殖器感染者中，HSV-1感染者复发率为14%，而HSV-2感染者则有60%复发。

复发性GH患者可有上述激发因素，或有前驱症状，全身症状较轻，复发部位多在原处，病程也较短，皮损约经10天左右即消退，由于病损反复发作，难以控制，患者易出现精神负担和性功能障碍，甚至发生抑郁症等，但其损害与原发性者甚为相似。

3.特殊型GH

（1）男性同性恋者GH：

本病仅次于淋球菌引起的肛门直肠炎，有人从62例有肛门直肠症状但淋球菌检查阴性的男性同性恋者中，29%检出了HSV-2，临床表现多为严重的肛门，直肠疼痛，其他症状为便秘，肛门内有分泌物，里急后重和发热等，部分病人肛周有水疱或溃疡。

（2）孕妇和新生儿GH：

孕妇患GH后，其后果严重，对妊娠GH患者HSV-2携带者来说，最重要的是传染给新生儿，当产道内存在HSV-2时，可有40%～60%的新生儿遭受感染，感染严重者可致死亡。

在妊娠早期，患GH的孕妇可影响胎儿，导致流产或死胎，新生儿的先天性感染，出生时可出现带状分布的疱疹，癫痫发作，出血倾向与肝脾肿大，如通过产道感染或胎膜早破而发生逆行感染时，轻者出生后数日至数周可无临床症状，早期可仅有吃奶较差，兴奋，以后可发生病毒血症或疱疹性脑炎，重者发生播散性HSV感染，可出现高热，呼吸困难，出血及中枢神经系统病变，预后不良。

因此，妊娠足月患GH者，如时间允许，应每周从阴道及子宫颈取材，检查有无病毒感染，若细胞学或病毒培养阳性而羊膜尚完整，或破裂后不足6h，建议剖宫产，以避免胎儿经阴道分娩而发生新生儿HSV感染。

HSV-2感染与宫颈癌：

有证据表明，生殖器HSV-2感染可能与宫颈癌的发生有关，血清流行病学检查发现，宫颈癌患者血清中抗HSV-2抗体较对照组妇女明显增高，Nahmias等发现，GH患者发生宫颈非典型增生者为对照组的2倍，而发生原位癌者则为对照组的8倍，近年来研究证明，患侵袭性宫颈癌和癌前期病变的妇女宫颈脱落细胞中,HSV-2抗原阳性率明显高于对照组，这种HSV-2抗原位于肿瘤细胞的胞质内，提示为肿瘤细胞表达的病毒抗原，有人发现，宫颈有高度非典型增生，原位癌及鳞状细胞癌者的活检组织中，用间接免疫荧光染色可发现其中的HSV-2抗原，应用DNA-RNA原位杂交技术在宫颈癌和癌前期组织中67%可发现HSV-2特异性mRNA，Frenkel等在宫颈癌组织中检出HSV-2的DNA，还有作者从手术切除后经放射的宫颈癌病变组织中分离出了HSV-2。

HSV-2感染与HIV感染与其他生殖器溃疡性疾病一样，GH增加了HIV感染的危险性，HSV感染是HIV感染的辅助因子，在HIV感染者尤其是HIV感染的同性恋者中，HSV-2感染率更高，且GH的并发症多而严重，在AIDS患者中，耐阿昔洛韦（无环鸟苷）的HSV毒株感染多见。

根据病史，症状和皮肤或黏膜表现，一般不难作出诊断，必要时可进行实验室检查，以明确病原体。

中医病机和辨证本病多因体内蕴热，外感毒邪，热毒相结，肝胆二经湿热下注而生;

或因肌肤虚弱，邪毒留肤，遇热即发。

中医辨证分型

1.湿热下注型

主证：

患处水疱，糜烂，痒痛交作，大便秘结，小便短赤，舌红，苔黄腻，脉弦滑数。

辨证：

湿热下注，外感毒邪。

2.肝肾亏损型

病情反复发作，兼有心烦寐少，腰酸头昏，食少乏味，口干咽燥，舌质淡，脉沉细。

清热化湿，养肝滋肾。

【注意事项】

大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下：

1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。

2.第二种就是慎用，就是药物可以使用，但是要密切关注患者口服药以后的情况，一旦有不良反应发生，需要马上停止使用。

3.第三种就是忌用，就是说明药物在此类人群中有明确的不良反应，应该是由医生根据病情给出用药建议。

如果一定需要这种药物，就可以联合其他的能减轻不良反应的药物一起服用。

大家以后在服用药物的时候，多留意说明书，留意注意事项，避免不良反应的发生。

本文到此结束，谢谢大家!