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2012年03月20日

毕业设计（论文）开题报告

1．结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写2000～4000字左右的文献综述：

文献综述

摘要：

对酪蛋白进行磷酸化改性，并进行酶解，研究磷酸化的酪蛋白对酶解的影响。

关键字：

磷酸化;

酪蛋白;

酶解

1、本课题研究的背景及意义

有关磷酸化蛋白营养特性的研究较多，采用三聚磷酸钠对食品蛋白质进行磷酸化改性，可同时改善食品蛋白质的功能特性和营养特性，且不影响食品蛋白的

消化率[2]。

磷酸化有选择地利用蛋白质侧链的活性基团，如Ser、Thr的-OH及赖氨酸的ε-NH2，引进的磷酸根基团增加了蛋白质的电负性，提高了溶解度。

磷酸根离子为所有生物代谢所必需，必须由膳食中取得，所以蛋白质的磷酸化改性是一种较实用、有效的方法。

资料表明，用三聚磷酸钠（STP）对蛋白质进行改性是安全可行的，其也是FDA允许使用的食品添加剂[3]。

我们知道在日常的生活中酪氨酸是非常的重要的，酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质。

牛奶的蛋白质，主要以酪蛋白（Casein）为主，人奶以白蛋白为主。

酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳（curds）。

酪蛋白为非结晶、非吸潮性物质，常温下在水中可溶解0.8-1.2%，微溶于25℃水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分，当浸入水中则迅速膨胀，但分子不结合。

酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽（CPPs）具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素（Ca、Mg）与微量元素（Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se）高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收，所以CPPs是最有效的促钙吸收因子之一，它的发现为补钙制品的研发提供了一种新方法。

目前，CPPs已被公认为国内外研究最多、最深入，应用领域极为广泛，且极具开发价值的一类分子结构与生物功能间有明确对应关系的活性多肽物质。

酪蛋白不是单一的蛋白质，它是由一类在构造和性质上相类似的蛋白质组成的，即αs-酪蛋白，β-酪蛋白，γ-酪蛋白，κ-酪蛋白[4,5]。

酪蛋白中含有人体必需的八种氨基酸，是一种全价含磷蛋白质[6]。

据报道平均分子质量一般在75000-350000之间，等电点约为4.6[7]，相对密度为1.25-1.31。

酪蛋白中超过55%的氨基酸是极性基团，这些极性基团对酪蛋白的亲水性和分子间的相互作用都有影响[8]。

酪蛋白长期以来被用作粘合剂、胶水、涂料黏附剂、皮革增亮剂、葡萄糖生物传感器的载体[9]，并且很早以来就被用于皮革涂饰，具有透气性强、手感好、耐有机溶剂、耐高温等特点。

酪蛋白的主要缺点是酪蛋白溶液涂膜后，膜吸湿性大，不耐湿擦，膜比较脆硬，易断裂、贮存时易受细菌腐蚀迅速变质等缺点。

经侧链化学接枝改性可以提高酪蛋白的性质，使其应用更为广泛。

首先酪蛋白的改性可以用来研究结构和功能的关系,更好地理解特定官能团对酪蛋白性质的影响,便于进行有目的的改性,扩大其用途，其次是提高其营养价值,牛乳中酪蛋白:

乳清蛋白为78:

15,而人乳中两者之比为40:

60,在母乳化奶粉生产中需添加价格昂贵的乳清粉以降低牛乳中酪蛋白的相对含量,如将牛乳中酪蛋白改性,即可经济实惠地达到这一目的。

另外,as-酪蛋白不易被婴儿消化吸收,而改性的酪蛋白消化率显著提高,最后,可以扩大酪蛋白在食品中的应用范围,这是酪蛋白改性的主酪蛋白表现出一定的功能特性，但并不能满足工业生产需要。

酪蛋白的添加虽能提高食品的营养价值，却没有有效改变食品的使用品质。

为了进一步扩大酪蛋白的应用领域，充分利用酪蛋白，使其更具专用功能性、营养性和生理活性，就需要对酪蛋白进行进一步的研究，目前最核心的就是进行蛋白质改性。

2、蛋白质改性的现状

在国内，卢寅泉（1993）等人采用三聚磷酸钠对大豆分离蛋白进行了化学改性，并对磷酸化蛋白的水溶性、乳化性、发泡性、持水能力以及流变特性等功能性进行了研究，发现它们都有不同程度的提高，但没有对其凝胶性的变化进行实验。

潘秋琴（1997）等人用POCl3对花生蛋白进行了磷酸化试验，发现磷酸化后蛋白的等电点与原样相比有大幅度的降低，显溶解度、乳化能力和乳化稳定性显著提高[10]。

田少君（2003）等采用三氯氧磷对大豆分离蛋白进行磷酸化，发现大豆分离蛋自的功能特性有了很大的改善；

用31P核磁共振谱，证实了三氯氧磷与大豆分离蛋白反应的实质主要是赖氨酸及精氨酸残基进行氨基磷酸酯化反[11]。

沈辉等用来源于酵母Yarrowia的酪蛋白激酶II对牛奶蛋白及大豆球蛋白（7S）磷酸化改性，改性后溶解度提高，溶解度受Ca2+浓度影响显著降低，根据文献报道，POCl3改性酪蛋白，在酸性条件下有较好的凝胶性[12]。

在国外，这方面的研究是相当多的，尤其在20世纪八、九十年代。

在过去的20年里，食品科学家们为改善食品蛋白质的功能特性采用了很多改性方法，其改性目的不外乎以下几种：

作为消除蛋白质中一些有毒或抗营养成分的手段；

用以提高或降低蛋白质的溶解性；

改善蛋白质的功能特性；

通过共价连接限制性必需氨基酸以提高蛋白质的营养价值；

用以提高蛋白质在加工过程中的稳定性[13]。

通过限制性水解或增加蛋白质分子中的亲水性基因可以提高蛋白质的溶解性。

可以通过在蛋自质上共价连接亲水性氨基酸残基、糖基或磷酸根基团实现。

早在1941年，Heidelberger就报道了卵蛋白的磷酸化。

Chiai-yanagi（1978）曾经尝试利用尿素变性的大豆蛋白进行磷酸化，但并没有发现大豆白的功能性得到明显提高[14]。

Woo（1982）曾成功地用POCl3对13-1actoglobulin进行磷酸化，并获得在碱性条件下稳定存在的磷酸化蛋白[15]。

Sung（1983）曾用状磷酸三钠磷酸化大豆蛋自，在pH=11.5，35℃，1％环状磷酸三钠条件下，大豆蛋自中30％的丝氨酸残基被磷酸化，由此制取的磷酸化大豆分离蛋白，水溶性、持水能力、乳化能力和发泡能力等功能性质大大改善且生物效应不降低[16]

Huang等（1986）分析磷酸化酵母蛋白的溶解度在pH=5.5-7.0之间有很大提高。

这是由于带电荷的磷酸基使水化作用增强，使蛋白结构松散化，持水力也有所增加。

可能有以四方面因素：

一是磷酸基的增加了水合作用；

二是由予带负电的磷酸基与羧基阴离子间相互斥力使强自结构松散化，从而，可以包裹更多的水分子；

三是磷酸基的电离作用，能结合更多的水；

四是磷酸化过程中或其后形成了空闻网状结构，水被束缚在网中。

Medina等（1992）用POCL3对酪蛋自进行磷酸纯，结果使其PI附近溶解度有所增加，而在碱性和酸性pH反而降低。

在pH<

pI时，蛋白分子带正电荷，磷酸化溶解度降低可能由于磷酸基的增加使改性后酪蛋白所带的净正电荷降低在pH>

pI时，蛋自质分子带负电荷，磷酸化结合的磷酸基增加了蛋白质的净负电荷，使之具有更开放的结构，疏水基团充分暴露，溶解度降低。

此外还有可能是因为用磷酰氯作磷酸化试剂会导致蛋白质分子之间发生交联，这些交联键的存在是导致蛋白水溶解性降低的原因。

但是可以通过磷酰氯改性蛋自来提高蛋自的粘度及胶凝性[18]。

3、蛋白质改性原理

蛋白质的改性方法包括物理改性、化学改性、酶法改性和基因工程改性等。

从分子水平来看，改性的实质是切断蛋白质分子的主链或是对蛋白质分子侧链基团进行修饰，从而引起蛋白质空间结构和物理性质的改变，是蛋白质的功能特性和营养特性的得到改善[19]。

化学改性和酶解改性是研究应用较多的改性方法。

4、酪蛋白改性的原理

酶法改性的作用点是蛋白链的肽键，化学修饰的作用点是氨基酸残基的侧链。

以化学方法加以带负电荷的磷酸基，增加了酪蛋白的溶解度、乳化能力、发泡能力、持水能力，故在众多化学方法中，磷酸化改性尤其引人注目。

4、1酪蛋白的化学改性

酪蛋白的化学改性主要是通过酰基化、烷基化和氧化还原等反应对酪蛋白的氨基酸残基的侧链进行修饰。

最常用的修饰就是氨基酸残基的酰基化，特别是赖氨酸残基的ε-氨基酸的酸化。

酪蛋白的磷酸化改性也是常用的方法，用STP、POCL3作为磷酸试剂；

另外，也可以用ATP在CK-Ⅱ（酪蛋白激酶Ⅱ）的存在下对酪蛋白进行磷酸化。

磷酸化还可提高酪蛋白对Ca2+沉淀的敏感性、粘度、多肽链分子的柔韧性及水化作用，酪蛋白与多羟基化合物的共价结合可以增加蛋白质的极性。

糖基化酪蛋白实际上是一种糖蛋白，其溶解性、粘度、表面特性及加热稳定性都得到提高。

改性后酪蛋白的水溶液在等电点附近得到提高，酰基化达到40%以上时乳化能力增强。

4、2酪蛋白的酶解改性

酶改性的酪蛋白中，酶水解也是常用的方法。

酪蛋白水解形成分子量较小的多肽链，具有较少的二级结构，可以提高蛋白质在等电点附近的溶解性，降低粘度，极大地改变了其发泡性、凝胶性和乳化作用。

但目前就对酪蛋白的改性研究来看，所用的酶主要是蛋白酶，其他的还有蛋白激酶，转谷氨酰酶等，但改性后虽然溶解性得到了提高，乳化能力却大多降低。

只有转谷氨酰酶的聚合作用改性的酪蛋白酶能提高乳化能力。

酶法改性的酪蛋白已应用于糖果和蜜饯的生产，含5%-40%多肽链的酪蛋白可以生产一种能替代鸡蛋蛋白用作蛋白糖霜的产品，胰蛋白酶改性的酪蛋白还可用于母乳奶粉的生产等。

总之酶法改性是一种非常有用的方法，这方面的研究仍待深入。

虽然目前改性方法较多，但其中最为常用的还是化学改性中的磷酸化改性。

5、磷酸化改性原理

蛋白质的磷酸化改性是常用的方法，是指选择性的利用蛋白质侧链活性基团，使无机磷酸与蛋白质特定的氧原子（Ser、Tyr、Thr-OH）或氮原子（Lys的氨基、Arg的胍基末端N）作用形成C-O-Pi或C-N-Pi的酯化反应（后者对酸不稳定，在pH≤7环境下发生水解，而前者在食品pH范围内稳定），使之变成（Thr、Tyr）Ser-PO32－和Lys-PO32-，从而引进大量磷酸根基团。

磷酸化的位置决定于化学反应的PH值[22].

磷酸化改性后蛋白中，由于引进大量磷酸根基团，从而增加蛋白质体系电负性，提高蛋白质分子之间静电斥力，使之在食品体系中更易分散，相互排斥，因而提高溶解度，聚集稳定性，降低等电点，而且其净电荷只有在相当低环境中才会被中和，故可有效拓宽在食品中应用范围。

磷酸化改性蛋白由于负电荷引入，大大降低乳状液表面张力，使之更易形成乳状液滴，同时也增加液滴之间斥力，从而更易分散，因此改性蛋白乳化能力及乳化稳定性都有较大改善。

6、本课题采用的实验方法

基于磷酸化后的酪蛋白的各种理化性质的改变，我们可以研究其对酶解程度的影响。

首先对酪蛋白进行磷酸化，然后进行酶解，将磷酸化后的酪蛋白对酶解程度与未磷酸化的酪蛋白酶解程度相对比，观看其影响程度。

具体的实验步骤：

取酪蛋白粉加入磷酸化试剂STP去5ml磷酸化溶液加入三氯乙酸将其中的酪蛋白进行沉淀，然后进行离心，取上清液加入乙酸锌，再进行离心，取沉淀，用PH10的氨缓冲溶液20ml溶解沉淀用EDTA进行滴定，测磷酸化程度适宜的条件下进行酶解灭酶水解液磷酸化程度的测定对酶解的影响测定

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２．本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）：

本课题要解决的问题：

酪蛋白的改性可以用来研究结构和功能的关系,更好地理解特定官能团对酪蛋白性质的影响,便于进行有目的的改性,扩大其用途。

酪蛋白不同的实验条件和不同的改性剂的存在下，其磷酸化的程度不同，本课题要解决的问题是确定磷酸化的最优的时间、温度、PH及磷酸化试剂的浓度。

拟采用的研究途径：

本课题拟用POCL3对酪蛋白进行磷酸化修饰，然后最佳条件下进行酶解，对磷酸化前后的酪蛋白解液进行测定，观察酶解液的水解度和蛋白质提取率的变化，从而得出磷酸化对花生蛋白酶解的影响。

具体步骤：

样品磷酸化单因素试验测样品磷酸化最佳条件（三聚磷酸钠浓度、反应时间、pH、温度）最佳条件下进行磷酸化测定磷酸化程度最佳酶解条件下进行酶解

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