Western blot 标准操作规程Word格式文档下载.docx

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在300mlH2O中溶解91gTris碱（1.5mol/L），用1mol/L调节pH至8.8,补加H2O至体积500ml。

用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2gSDS[0.4%（w/v）]，于4℃可保存1月。

3）4×

Tris•Cl/SDS,pH6.8,

在40mlH2O中溶解6.05gTris碱（0.5mol/L），用1mol/L调节pH至6.8,补加H2O至体积100ml。

用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4gSDS[0.4%（w/v）]，于4℃可保存1月。

4）4×

SDS电泳缓冲液

Trisbase24.2g

Glycerin115.3g

20%SDS20ml

加水至总体积1000ml。

应用时稀释4倍即为1×

SDS电泳缓冲液（Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%）。

5）TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。

6）10%过硫酸铵

【步骤】

1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。

2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10％的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。

表7.1聚丙烯酰胺分离胶的配制

试剂成分配制不同浓度分离胶所需试剂（ml）

5%8%10%12%15%

Acry:

Bis（30:

0.8）2.504.005.006.007.50

4×

Tris•Cl/SDS,pH8.83.753.753.753.753.75

H2O8.757.256.255.253.75

10%过硫酸铵0.050.050.050.050.05

TEMED0.010.010.010.010.01

按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5％的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。

3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。

样品体积少于10μl不需灌制积层胶。

4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。

让凝胶在室温聚合30min。

聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。

5）倾去顶层的异丁醇，并以1×

Tris-Cl/SDS,pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。

6）按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。

表7.2聚丙烯酰胺积层胶的配制

GEL%（3.9%）Total（10.05ml）

Bis（30:

0.8）1.30ml

Tris•Cl/SDS,pH6.82.50ml

H2O6.10ml

10%过硫酸铵0.05ml

TEMED0.01ml

7）将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。

让积层胶室温聚合30min。

8）在具螺口盖的微量离心管中，用2×

SDS加样缓冲液按1:

1（v/v）稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。

如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100µ

l1×

SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。

按供应商的使用指南用2×

SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。

对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20µ

l为宜。

用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50µ

g，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10µ

g蛋白量。

采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20µ

l的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。

2×

SDS加样缓冲液（loadingbuffer）配制：

成　　分体积（ml）

0.5MTris•Cl（pH6.8）12.5

20%SDS11.5

Glycerin10

2%Blue-Bromo-phenol2.5

β-mercaptoethanol*5.0

加H2O至总体积50ml，分装

*β-mercaptoethanol在临用前加入。

9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。

取出梳子后，以1×

SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。

10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×

SDS电泳缓冲液。

11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。

12）用带平嘴针头的50µ

l注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×

SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。

13）再往上槽加入余下的1×

此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。

14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。

过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。

可用去离子水配制小量10%（w/v）的贮存液并保存于4℃。

由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。

15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。

连同上槽一起将凝胶夹层取出。

16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。

17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。

18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。

19）转膜

将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。

（100V，1小时）要放于4℃。

WesternBlot详解（原理、试剂、步骤及问题解答）

Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术:

一、原理

二、分类

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

iii.底物荧光ECF

iv.底物DAB呈色

三、主要试剂

四、主要步骤

五、实验常见的问题指南

1.参考书推荐

2.针对样品的常见问题

3.抗体

4.滤纸、胶和膜的问题

5.Marker的相关疑问

6.染色的选择

7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索

10.方法的介绍

11.结果分析

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类

western显色的方法主要有以下几种：

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

iii.底物荧光ECF

iv.底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：

反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂

1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

）储于棕色瓶，4℃避光保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:

10%（w/v）0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:

1.5mmol/LTris-HCL（pH8.8）:

18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

4、浓缩胶缓冲液:

0.5mmol/LTris-HCL（pH6.8）:

6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

PH太低时，聚合反应受到抑制。

10%（w/v）过硫酸胺溶液。

提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。

去离子水配制数ml，临用前配制.

6、SDS-PAGE加样缓冲液:

pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。

按1:

1或1:

2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:

30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。

临用前稀释10倍。

8、转移缓冲液：

配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、丽春红染液储存液：

丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。

使用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%（w/v）。

11、NaN30.02%叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）。

12、Tris缓冲盐溶液（TBS）:

20mmol/LTris/HCL（pH7.5），500mmol/LnaCl。

13、Tween20（15）鼠抗人-MMP-9（16）鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

15、NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

16、BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

17、100mmol/LTris-HCL（pH9.5）。

18、100mmol/LNaCl。

19、50mmol/LTris-HCL（pH7.5），5mmol/LEDTA。

根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！

）：

1.参考书推荐

A.对初学者看什么资料比较好？

解答：

《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratorymanual，wrotebyEdHarlow，davidlane）两本书不错。

2.针对样品的常见问题

B.做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。

是什么原因？

蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

怀疑是样品问题，可能是：

1，样品不能反复冻融；

2，样品未加蛋白酶抑制剂。

同时，建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。

对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

C.细胞水平要做WesternBlot，多少细胞提的蛋白够WesternBlot？

一般地5*106就足够了。

D.同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对WesternBlot有无影响?

能，没有问题，我们做过。

E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？

当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。

H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？

积层胶的浓度又该用多少？

这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？

260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，StackingGel3.5％。

I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？

如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。

可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。

一般地，超载30％是不会有问题的。

如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。

J.蛋白变性后可以存放多久？

－80℃，一两年没有问题。

最关键两条：

不要被蛋白酶水解掉；

不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。

K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

L.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？

好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

M.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。

开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。

要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。

所以拿到好的结果不容易。

N.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？

还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？

浓度如何？

效果是不是比BSA好一点？

必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。

还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。

如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。

O.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

做200kd蛋白的WesternBlot时要注意，分离胶最好选择>

7%的；

剥胶时要小心；

转移时间需要相应延长；

要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

P.有什么方法可以提高上样量？

可以浓缩样品；

增大上样体积来增大上样量。

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发表于2009-7-312:

04|只看该作者

Q.我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？

如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做WesternBlot就可以了。

如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。

42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。

S.一抗，二抗的比例是否重要？

比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

3.抗体

T.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WesternBlot，其二抗有何要求？

对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？

我用的ELL+plus试剂盒显色。

转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。

不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。

我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。

至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；

转膜的设备，是半干式，还是湿式。

一抗当然可以过夜，如果你想所短WesternBlot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；

你可以参照抗体说明书。

至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：

1500；

二抗1：

20000试试。

另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；

一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！

V.免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？

免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；

线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；

构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。

如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。

（限于单抗）

W.WesternBlot中抗体的重复应用问题

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。

稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

4.滤纸、胶和膜的问题

X.NC膜\PVDF膜\尼龙膜怎样鉴别？

尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；

硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；

PVDF膜介于二者之间。

就结合能力而言：

尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合