四川省卫生厅科学研究项目申报书概要Word下载.docx

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1.提取、分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，并对其进行原代、传代的细胞扩增培养。

将获得的原代和传代培养的兔骨髓间充质干细胞，在成软骨诱导剂下采用支架进行三维成软骨诱导培养，对诱导培养细胞－支架复合体块进行大体观察、HE染色、阿新兰染色、甲苯胺兰染色检测软骨细胞基质的合成，并进行免疫组化及以RT-PCR检测诱导后的细胞

型胶原的表达。

2.上述细胞－支架复合体在经成软骨诱导因子体外诱导培养3周后，将该细胞－支架复合体植入裸鼠体内继续培养，以构建工程化软骨。

分别在植入后第6、10周将植入物取出，采用大体观察、HE染色、阿新兰染色、甲苯胺兰染色，免疫组化以及原位杂交等鉴定构建的组织的软骨分化情况。

二、研究背景和依据（国内外研究现状、发展趋势、必要性、新颖性、创新点、研究意义）

研究必要性：

软骨与骨不同，在体内的再生能力很差，一旦因各种原因损伤，软骨难以自身修复，最终软骨缺损、造成功能病废。

自Hunter首先认识到这一现象以来，针对软骨修复的研究已有250年的历史[1]。

对于严重的软骨损伤与缺损，虽然软骨移植或骨软骨移植有较好的软骨修复效果[2]，但因供体来源有限，妨碍了这种方法的广泛应用。

而软骨细胞移植存在细胞悬液容易在移植区流失的问题[3]，另外，虽然骨膜移植或软骨膜移植以及支架材料充填等方法都能在软骨损伤、缺损处形成修复组织，并缓解临床症状，但通常修复组织质量较差，常为纤维软骨，常常不能达到长期恢复功能的效果[4]，因此寻找组织工程化软骨十分必要。

国内外研究现状和发展趋势：

近年来，基于组织工程和基因工程技术发展起来的细胞或组织替代治疗是整个生命科学领域中的研究热点和前沿，为人类征服多种疾病提供了新的途径和希望。

组织工程的研究主要包括以下三个方面：

种子细胞的离体培养研究，细胞外基质替代物（生物材料）的研究，组织工程化组织的构建研究。

其中对离体培养的种子细胞的要求是

取材方便；

在体外应用有较强的增殖能力；

能适用材料和受区环境；

能在受区完全替代缺失细胞的功能。

软骨细胞在软骨组织工程中应用研究起步较早，研究较多，但研究发现有如下的缺点：

自体来源的软骨细胞有限，且随着年龄增大，获得的软骨细胞数量减少，取材不便，对供体部位造成一定伤害，同种异体或异种来源的软骨细胞，不但来源有限，而且易于造成疾病传播。

所以，选择能满足要求和易于操作的靶细胞又是组织工程的一个关键的问题。

骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcellsderivedfrombonemarrow,MSC）,是中胚层发育的早期细胞，在1867年,Cohnheim在实验中给动物静脉注射一种不容性染料analine，结果在动物损伤远端的部位发现含有染料的细胞，包括炎症细胞和与成纤维合成有关的成纤维细胞，并认为这些细胞来自骨髓，这是最早提出骨髓具有造血外还有其他功能的报道[5]。

但受到当时条件的限制，这些研究未能深入进行。

直到20世纪70年代，研究人员开始重新认识到骨髓中这种造血以外的细胞的意义并开展了相关的研究。

Friedenstein等[6]在1971年实验中发现塑料培养皿中培养的貼壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过10个培养周期仍能保持其多向分化潜能，后来，证明这类细胞就是骨髓间充质干细胞，将这些细胞植入小鼠的腹腔可以形成软骨样或骨样组织[7]。

这些工作对骨髓间充质干细胞的研究具有重要的意义，进一步证实了骨髓间充质干细胞的存在，并创建了一种较经典的分离此类干细胞的方法，该方法后来得到了较广泛的应用。

研究的创新点及其意义：

骨髓间充质干细胞的多方向分化具有高度的进化保守性，人、狗、兔、猪、大鼠和小鼠，甚至禽类的骨髓的间充质干细胞均有相似的特点[8]。

如今，针对骨髓间充质干细胞进行分离、纯化、培养的条件正在不断进行优化[9]，同时也在不断优化骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞的诱导培养条件和方式，探讨骨髓间充质干细胞在骨和软骨损伤中的应用的研究已显示出良好的前景。

由于骨髓间充质干细胞来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于通过梯度离心和体外貼壁培养法分离培养，而且其体外增殖能力强，易于进行基因修饰，并易于调整骨髓间充质干细胞表达所需的细胞因子，因此，有的学者甚至认为骨髓间充质干细胞将来可能成为生物组织工程理想的靶细胞，有着广泛的应用前景，特别是骨髓间充质干细胞向软骨组织立体定向诱导分化，构建工程化软骨值得广泛深入研究。

参考文献：

1JessenBA,StevensGJ,Expressionprofilingduringadipocytedifferentiationof3T3-L1fibroblasts.Gene2002,299

（1）783.

2.OuterbridgeFK,OuterbridgeAR,OuterbridgeRE.Theuseofalateralpatellarautologousgraftfortherepairofalargeosteochondraldefectintheknee.JBonejointSurg1995;

77A:

65.

3.MinguellJJ,EricesA,CongetP.Mesenchymalstemcells.ExpBiolMed.2001Jun;

226（6）:

507-20.

4.KlompmakerJ,JansenFWB,VethRPFetal.Porouspolymerimplantsforrepairoffull-thicknessdefectsofarticularcartilage:

anexperimentalstudyinrabbitanddog.Biomaterials,2004;

13:

625.

5.ProckopDJ.Marrowstromalcellsasstemcellsfornonhematopoietictissue.Sciences,1997;

276:

71-74.

6.FriedensteinAJ,ChailakhyanRK,GerasimovUV,Bonemarrowosteogenicstemcells:

invitrocultivationandtransplantationindiffusionchambers.CellTissueKinet,1987;

20:

263-272.

7.PattHM,MaloneyMA,FlanneyML.Hematopoieticmicroenviromenttransferbystromalfibroblastsderivedfrombonemarrowvaryingincelluarity.ExpHematol,1982;

10:

738—742.

8．JohnsonMD,OkedijiE,WoodondA.Transforminggrowthfactor-betaeffectsonmeningionmacellproliferationandsignaltransductionpathways.JNeurooncol.2003,66（1~2）:

9~16.

9.刘晓丹，郭子宽，李秀森，等。

人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立。

军事医学科学院院刊，2000，24（4）：

282－284.

三、研究方法、技术路线、计划进度和阶段目标

研究方法与技术路线：

1.兔骨髓间充质干细胞的提取、分离、原代及传代培养。

取日本大耳兔20只，用2％利多卡因于兔髂骨上棘处施以局部麻醉，在无菌操作下以骨髓穿刺针刺入兔髂骨骨髓腔，抽出骨髓，经低糖的DMEM稀释后，进行梯度离心，离心后吸取悬浮细胞，洗涤后进行骨髓间充质干细胞的原代、传代扩增培养。

2.采用流式细胞仪检测细胞的表面抗原。

消化分离并收集骨髓间充质干细胞，加入500ul适当稀释度的FITC标记的鼠抗兔CD14、抗CD29、抗CD44、抗CD34、抗CD45mAb,反应30min,用流式细胞仪检测。

3．对骨髓间充质干细胞进行立体成软骨诱导培养及其诱导后检测。

（1）构建细胞－支架复合体进行立体成软骨诱导

实验组：

将聚羟基乙酸（PGA,美国Albany公司）剪成1.2×

1cm2大小，并以多聚赖氨酸包被，将扩增的骨髓间充质干细胞消化分离，调整细胞浓度5×

107/ml，按200ul/cm2接种在PGA支架上，在含10％FBS的DMEM中培养，次日换为无血清诱导培养液，其主要成分是DMEM中含有转化生长因子ß

110ng/ml（TGF-ß

1，Promega公司，美国）、地塞米松10-7M（Gibco公司）、抗坏血酸50mg/L（Gibco公司）以及1％ITS-A（主要含有胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸，Gibco公司），将细胞－支架复合体置于37℃、5％CO2培养箱中，体外诱导培养。

对照组：

PGA支架上不加入骨髓间充质干细胞，在其他条件相同情况下体外培养。

（2）结果鉴定：

分别在诱导培养后的第2、3周取出实验组与对照组的细胞－支架复合体，进行诱导培养后的复合体固定、切片作HE染色学检查、阿新兰染色、甲苯胺兰染色。

分别在诱导培养后的第2、3周取出实验组与对照组的细胞－支架复合体，进行诱导培养后的复合体固定、切片，用免疫组化检测诱导培养后的细胞的

型胶原表达。

分别在诱导培养后的第2、3周提取实验组与对照组中的总RNA，以RT-PCR检测诱导后细胞中

型胶原mRNA的表达。

PCR反应采用25ul反应系，PCR扩增条件为：

94℃，30sec；

60℃，45s；

72℃，延伸1min，30个循环。

1.5%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。

产物片段为352bp。

4.将诱导培养后的细胞－支架复合体进行工程化软骨的构建并检测体内培养后成软骨分化情况。

（1）细胞－支架复合体的工程化软骨的构建：

将上述实验组与对照组的细胞－支架复合体在体外诱导培养3周后，将复合物分别植入裸鼠体内继续培养6、10周。

（2）细胞－支架复合体的工程化软骨的构建后的软骨分化情况的检测：

分别在裸鼠体内诱导培养第6、10周后取出实验组与对照组的细胞－支架复合体的工程化软骨，对其进行大体观察后，以10％中性甲醛固定，行5um切片，采用HE染色观察构建的工程化软骨的一般形态学特点。

分别在裸鼠体内诱导培养第6、10周后取出实验组与对照组的细胞－支架复合体的工程化软骨，固定，切片后，进行阿新兰染色观察酸性粘多糖形成，苯胺兰染色观察异染性间充质。

分别在裸鼠体内诱导培养第6、10周后取出实验组与对照组的细胞－支架复合体的工程化软骨，固定，切片后，进行免疫组化检测

型胶原蛋白的表达。

分别在裸鼠体内诱导培养第6、10周后取出实验组与对照组的细胞－支架复合体的工程化软骨，固定，切片后，进行体内诱导培养后的原位核酸分子杂交检测

计划进度和阶段目标：

05年12月

购买仪器、试剂、药物和动物，完成预试实验

06年6月

正式实验，完成骨髓间充质干细胞分离、纯化、原代及传代扩增培养，采用流式细胞仪检测细胞的表面抗原。

06年12月

构建骨髓间充质干细胞－PGA支架复合体,对骨髓间充质干细胞进行体外立体成软骨诱导培养及其诱导后检测（苯胺兰染色、阿新兰染色、免疫组化、RT-PCR等）。

07年12月

将诱导培养后的细胞－支架复合体植入裸鼠体内培养，进行体内工程化软骨的构建及其检测（组织切片HE染色、苯胺兰染色、阿新兰染色、免疫组化、原位杂交等）。

08年4月

总结资料，撰写论文，申请成果鉴定。

四、现已具备的条件（包括前期研究工作、实验室设备、实验动物和动物实验、信息资料等基本条件）

申请者在四川大学华西医院读博士期间，参与了相继由国家自然科学基金与博士点专项基金以及美国纽约中华医学会基金会资助以骨髓间充质干细胞为主题的一些实验研究，接触并阅读了大量的关于骨髓间充质干细胞的国内外的前沿研究，以此为基础，申请者自行设计出博士毕业论文《骨髓间充质干细胞多方向诱导分化的实验研究》，并进行了大量的相关实验，并撰写了较多的相关文章（发表的相关文章已被EI所收录1篇，被medline所收录2篇，核心期刊1篇，统计源期刊2篇），有较丰富的理论及实验基础。

本课题将依托省级重点实验室－泸州医学院心肌细胞生理研究室，依托泸州医学院病理、分子生物学中心实验室的客座研究空间，将继续对骨髓间充质干细胞进行了深入研究。

同时，本课题组其他研究成员也均有丰富实验课题研究经验，实验分工均是他们擅长的领域。

本研究课题所需的实验条件及设备已基本具备。

本课题所需的试剂均可通过生物试剂公司在市场上购买到。

实验动物在泸州医学院实验动物中心购买。

骨髓间充质干细胞的分离及培养在泸州医学院电生理研究室的细胞培养室进行（目前，前期实验已将骨髓间充质干细胞的分离、纯化以及原代、传代培养已经完成）。

诱导培养后的所构建的组织工程化软骨组织的切片、免疫组化、原位杂交以及RT-PCR都分别可在泸州医学院病理室、分子生物学实验室完成（后期内容需要资助）。

五、预期目标、成果应用前景、社会效益

预期目标：

在分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞后，将获取的骨髓间充质干细胞接种在聚羟基乙酸（PGA）上并在无血清成软骨诱导细胞因子作用下进行体外诱导培养，获取到早期的软骨细胞－支架复合体，最后，通过将细胞－支架复合体接种在裸鼠体内继续培养，获取到所需的工程化软骨组织块。

应用前景及社会效益：

由于骨髓间充质干细胞来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于通过梯度离心和体外貼壁培养法分离培养，而且其体外增殖能力强，易于修饰、易于调整所需的细胞因子，因此，在国内外该相关研究已显示出良好的前景。

若本课题能获得资助开展，在前期将骨髓间充质干细胞向软骨组织诱导分化获得的成功的基础上，深入研究，构建出工程化软骨组织块。

那么，本课题的研究成果必将大大地推动骨髓间充质干细胞在骨和软骨损伤及缺损中的临床应用的进程，其成果必将产生重要的临床意义、广泛的社会效益。

六、申报单位已经和拟采取的保障措施（人、财、物、管理）及配套条件安排情况

申报单位已具备完成实验课题所需的实验设备和实验技术人员，并有完善的管理和监督措施，申报单位对科研高度重视，有从事科研的各类人才以及需要科研平台的研究生，在实验经费支持下可确保课题的顺利和按时完成。

七、经费预算

支出科目

金额（万元）

预算根据或理由

经费概算总计

1.7

合计以下项目

业务费

0.05

购买课题相关资料

试验材料费

0.85

购买日本大耳兔30（30元/只），化学试剂（各种生理盐溶液、标准试液，计0.26万），实验药品（各种细胞诱导因子，计0.5万）

小型专用仪器设备费

0.5、

支架购买加工

协作费

0.1

与基础医学院合作

差旅费

参加交流，申请鉴定

管理费

其它费用

八、项目或课题负责人情况表

姓名

性别

男

出生年月

技术职称

行政职务

最后学历

博士

从事专业

耳鼻咽喉－头颈外科

主要业务经历及近两年承担科研项目情况

1995年7月～1999年9月在绵阳市第四人民医院从事耳鼻咽喉科临床工作。

2004年7月～至今在泸州医学院附属医院耳鼻咽喉－头颈外科从事临床、科研、教学工作。

主研课题：

2004年泸州医学院校级科研基金资助课题－耳蜗Ⅰ、Ⅱ型螺旋神经节细胞的电生理研究（№：

0488）。

参研课题：

2002年四川省卫生厅科研课题－骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的基因调控（№：

020060）

近两年科技成果获奖情况（名称、时间、等级）

无

国内外学术团体、专业学会、学术期刊任职情况

近两年发表的主要论文（题目、刊名、时间）及主要论著

1.骨髓间充质干细胞研究进展《国外医学.耳鼻咽喉科分册》2003，27（3）149～151.第一作者。

2.体外单层培养法诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究《山东医药》2003，21

（2）22～33.第一作者。

3.骨髓间充质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞诱导分化的实验研究《生物组织工程学杂志》2003，20

（2）209～211.第二作者。

4.骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究《四川医学》2004，24（14）1216～11218.第一作者。

5.兔骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨组织的实验研究《临床耳鼻咽喉科杂志》2005，19（4）168～172第一作者。

6.兔骨髓间充质干细胞成骨与成脂诱导分化之间的关系的实验研究《中华老年医学杂志》已接受第一作者。

国内外学习、进修情况

1999年9月～2001年7月在四川大学华西医学中心攻读硕士。

2001年9月～2004年7月在四川大学华西医学中心攻读博士。

十、项目或课题参加单位、协作单位及分工

参加单位分工

泸州医学院附院课题管理、细胞－支架的构建、植入与取出等

协作单位分工

泸医心肌细胞电生理实验室细胞的分离、扩增培养，支架构建等

泸医病理实验室组织切片、常规染色等

泸医分子生物学实验室免疫组化、原位杂交，RT-PCR等

泸医动物实验中心动物培养

十一、查新检索摘要

现有文献表明：

骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养的条件已不断进行优化，探讨骨髓间充质干细胞在骨和软骨损伤中的应用的研究已显示出良好的前景。

由于骨髓间充质干细胞来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于通过梯度离心和体外貼壁培养法分离培养，而且其体外增殖能力强，易于进行基因修饰，并易于调整骨髓间充质干细胞表达所需的细胞因子，因此，有的学者甚至认为骨髓间充质干细胞将来可能成为细胞和基因治疗理想的靶细胞，有着广泛的应用前景，特别是骨髓间充质干细胞向软骨组织诱导分化，值得广泛深入研究。

十二、本单位学术委员会意见

该课题立题新颖，实验设计严密、合理，该课题所研究的内容属于当今国内外组织工程学研究的热点及前沿，若获资助并完成实验，实验的结果对推动国内外组织工程化软骨的构建的发展具有重要意义。

负责人（签章）（公章）

年月日

十三、申报单位意见

已按填报说明对申请人的资格和申请内容进行审核。

实验所需的设备和条件我单位已基本具备。

申请项目若获立项，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等给予保证，督促负责人按规定及时报送材料。

（公章）

负责人（签章）年月日

十四、市、州卫生局或主管部门意见

十五、专家委员会评审意见

组长（签章）年月日

十六、四川省卫生厅审批意见