KAP71基因在辽宁新品系绒山羊毛囊中的Word格式.docx

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4.2.3退行期KAP7.1基因RT-PCR产物的扩增曲线及融解曲线分析7

4.2.4KAP7.1基因在毛囊兴盛期和退行期初次级毛囊中的相对表达量8

5讨论9

参考文献11

致谢13

KAP7.1基因在辽宁新品系绒山羊毛囊中的表达研究

中文摘要:

羊绒是山羊的内层毛被，是次级毛囊的产物，其纤维具轻柔、光滑、细软等特点，是高档的纺织原料。

绒的优良品质与组成它的结构蛋白—角蛋白和角蛋白关联蛋白有着密切的关系。

本实验采用实时荧光定量RT-PCR技术对我国特有的动物资源——辽宁新品系绒山羊毛囊中的KAP7.1基因的表达进行了研究，利用SDS软件对实时荧光定量RT-PCR的检测结果进行了分析，代入基因相对表达水平的公式计算基因的相对表达水平，得出角蛋白关联蛋白KAP7.1基因在毛囊中表达的差异性及表达的倍数关系，从而为寻找调节绒山羊绒细度相关基因提供依据。

实验的结果表明：

在毛囊兴盛期，角蛋白关联蛋白KAP7.1基因在次级毛囊中的表达量高于初级毛囊中的表达量，KAP7.1基因在次级毛囊中的相对表达量是初级毛囊的2.28倍，而毛囊退行期KAP7.1基因在初级毛囊中的相对表达量约是次级毛囊的1.11倍。

我们从分子水平出发，用实时荧光定量RT-PCR对新品系绒山羊的功能基因进行分析，并研究其与经济性状（绒细度）的相关关系，旨在为新品系绒山羊种质资源的保护及开发利用积累一定的基础资料，为下一步新品系绒山羊绒纤维直径大小的调节机制奠定一定基础。

关键词：

辽宁新品系绒山羊实时荧光定量RT-PCRKAP7.1基因经济性状

ExpressionofKAP7.1inthehairfollicleofCashmeregoats

Abstract:

TheexperimentaluseofQuantitativeRT-PCRonChina'

suniqueanimalresources-theprimaryhairfollicleandsecondaryhairfollicleofLiaoningnewlinecashmeregoatshavebeenstudied,andtheuseofSDSsoftwareanalyzestheresultwhichisgotbyQuantitativeRT-PCR,thensubstitutethescorestotheformulaofrelativeexpressionlevelofgeneinordertocomputegenerelativeexpressionlevel,afterdoingthat,wecangetthedifferenceandmultiplerelationshipofexpressionofKeratinassociatedproteinKAP7.1,atlastwecouldprovidetheevidenceforlookingforthecorrelativegenesofthecashmerefinenessofcharactersofcashmeregoats.TheresultoftheexperimentindicatesthatKeratinassociatedproteinKAP7.1hashigherexpressionquantityinthesecondaryhairfolliclethantheprimaryhairfollicleinanagen,theexpressionofsecondaryhairfollicleis2.28timeshigherthantheexpressionofprimaryhairfollicle,whiletheexpressionofprimaryhairfollicleis1.11timeshigherthansecondaryhairfollicle.Fromthemolecularlevel,thatwecananalyzethefunctiongenesofnewlinecashmeregoatsandresearchtherelationshipbetweenthefunctionandeconomicalcharacter（thecashmerefineness）istoaccumulatecertainbasicmaterialsforprotectanddevelopmentanduseofvarietyresourcesofnewlinecashmeregoats,sothatitwillmakesomefoundationforadjustmentmechanismaboutcashmerefiberdiameterofnewlinecashmeregoats.

Keywords：

LiaoningnewlinecashmeregoatsQuantitativeRT-PCRKAP7.1geneEconomicCharacters

1.前言

绒山羊是具有多种用途的山羊品种，其产品多样，特别是山羊绒[1-2]。

辽宁省瓦房店具有独特的水土资源，于八十年代初期开始培育一种多绒类型的绒山羊，单只产绒量居全国第一。

绒山羊的体重和绒毛性状是绒山羊生产的重要经济性状，它们直接影响着绒山羊生产的经济效益。

在研究与绒山羊经济性状相关基因的过程中，实时荧光定量PCR可以精确地检测绒细度相关基因的表达水平。

由于实时荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、速度快、通量高、无需PCR后电泳等特点，已成为基因定量检测的金标准。

近年来，利用实时荧光定量RT-PCR法代替普通PCR法进行各种基因的检测越来越盛行。

荧光定量PCR技术不仅应用于基因表达分析，还广泛应用于医学检测、药物疗效考核、基因表达研究、转基因研究、基因检测、食品检测等各领域[3-4]。

绒毛是山羊皮肤的衍生物，初级毛囊生长毛，次级毛囊生长绒。

角蛋白（Keratin）和角蛋白关联蛋白（Keratinassociatedprotein，KAP）是绒毛的主要结构蛋白，它们决定了羊绒的基本特性。

绒山羊绒毛的生长呈现周期性变化规律，在一个年周期内其毛囊活动通常经历兴盛期（anagen），退行期（catagen）和休止期（telogen）。

依据氨基酸的成分的不同，KAP7.1为高甘氨酸／酪氨酸角蛋白家族。

目前，实时荧光定量PCR为技术的研究国内和国外的研究报道有很多。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

但对角蛋白关联蛋白基因在绒山羊初、次级毛囊中的表达进行研究，并与经济性状相关联的研究还未见报道[5-6]。

我们采用PCR-SSCP的分子标记技术，选择编码羊毛纤维组成蛋白基因中的KAP7.1的外显子区作为候选基因，通过对其多态性的研究，可以探索将该基因作为候选基因来间接选择羊毛细度性状的可行性。

有研究表明，在甘氨酸酪氨酸角蛋白辅助蛋白中，外显子W06933的AA基因型和BB基因型与羊毛细度之间有显著的相关性（P<

0.05），即KAP7.1可以作为绒细度的候选基因。

因此只要通过分析，找出决定羊毛细度的候选基因,就可以通过基因型对细度进行标记选择，这正是我们所说的标记辅助选择。

而我们所选基因编码的蛋白质正是羊毛纤维的组成成分，将其作为候选基因具有一定的功能基础[7-8]。

绒山羊的绒毛性状是绒山羊生产的重要经济性状，它们直接影响着绒山羊生产的经济效应。

近年来，我国生产的羊绒一直占居世界贸易量的50%以上，出口羊绒及其制品为国家换取了大量的外汇，为改善和提高人民生活水平，促进农村经济发展，搞活一方经济，富裕一方人民，起到积极的推动作用。

山羊绒的细度是羊绒价格的决定性因素，细度低于20微米的羊毛价格比粗羊毛高十几倍，近年来绵羊的育种方向也在向细型发展，但是我国的许多优秀的绒山羊品种的绒细度有逐渐增高的趋势，因此对绒山羊细度的选育势在必行[9]。

在育种过程中，选择降低羊毛细度将会导致毛囊密度的增加，说明羊绒细度和毛囊密度呈负相关。

但在实际育种中，由于细度性状的遗传力很低，传统的杂交育种费时费力效果又小明显，因此从基因水平上深入了解毛囊发育和周期性生长，特别是次级毛囊的起源、发育和周期性生长的机理，对于控制绒山羊产绒的细度是非常必要的[10-12]。

因此，本实验以辽宁新品系绒山羊为材料，利用实时定量RT-PCR首次对初、次级毛囊中的KAP7.1基因的表达进行了准确的定量，为调节绒纤维品质的研究奠定了基础。

本实验以辽宁新品系绒山羊为材料，选择初，次级毛囊进行研究。

首先分离初，次级毛囊并分别提取毛囊总RNA，确定反转录的条件后分别反转录生成cDNA，然后确定引物再分别进行实时荧光定量RT-PCR反应，最后分别收集荧光信号。

根据计算机显示结果，利用图像分析软件，对角蛋白关联蛋白KAP7.1基因在新品系绒山羊初、次级毛囊中的表达进行比较分析，通过对数据进行统计运算和分析，得出角蛋白关联蛋白KAP7.1基因在初，次级毛囊中表达的差异性及表达的倍数关系，从而为寻找调节绒山羊绒细度相关基因提供依据[13]。

本研究具有很重要的意义，辽宁新品系绒山羊是我国特有的遗传资源，具有绒长毛短、绒毛明显外露、且单只产绒量居全国第一等特性[14]。

由于绒品质优良，辽宁新品系绒山羊同内蒙古绒山羊被称为我国最优秀的两个绒山羊代表品种。

并且，辽宁新品系绒山羊的绒长度和绒产量均明显高于内蒙古绒山羊，但绒细度要比内蒙古绒山羊粗许多。

由于绒比毛贵，绒细度又是价格的决定因素。

因此，对绒毛纤维直径的研究就成为辽宁绒山羊育种研究的重中之重。

本实验通过对绒毛纤维功能相关基因KAP7.1的研究，旨在从分子水平上控制辽宁新品系绒山羊的绒细度，为最终达到调控羊绒生长提供可靠的理论依据[15]。

2.实验材料

2.1标本处理

标本来源：

成年健康辽宁新品系绒山羊体侧部皮肤。

取2-3块皮肤带回实验室，尽量剪去裸露毛干，生理盐水冲洗去表面污物，浸入生理盐水中，在托盘尽量刮去裸露毛干及皮下脂肪，生理盐水冲洗去表面污物，碘酒擦拭及75%乙醇脱碘，浸入生理盐水中带入无菌间。

超净台中弃生理盐水加入95%乙醇（约2～3分钟），皮肤用生理盐水洗三次，将皮肤切成宽约0.8～1.0cm的皮条，在生理盐水中洗三次后室温下放置等待分离毛囊。

2.2毛囊的分离

常规毛囊机械分离法：

皮条在生理盐水中反复洗后在体式显微镜下用小镊子夹住皮条两表面，挤出侧面完整毛囊的毛乳头，用睫毛夹夹住毛囊外根鞘部顺毛球方向将毛囊拔出，在室温下放入含生理盐水的培养皿中，在体式显微镜下用解剖针在不损伤毛囊的前提下将毛囊周围组织尽量剔除，然后将毛囊移入培养液中培养。

本文里，我们采用改良的毛囊机械分离法：

皮条在生理盐水中反复清洗后，在玻璃培养皿中切成尽量薄的皮片（只含单层毛囊），在体式显微镜下用解剖针固定皮肤，切除待分离毛囊的周围组织，将其放入含生理盐水的培养皿中，在体式显微镜下用解剖针在不损伤毛囊的前提下将毛囊周围组织尽量剔除，然后将毛囊移入培养液中培养。

2.3试剂及仪器

2.3.1试剂的配制

（1）DNase－freeRNase：

溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH5.0）。

溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。

用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。

（2）醋酸钠溶液：

称量40.8gNaAc·

3H2O置于100-200ml烧杯中，加入40ml的去离子水搅拌溶解，加入冰醋酸调节pH值至5.23，加去离子水将溶液定容至100ml高温高压灭菌后，室温保存。

（3）70%乙醇（75%乙醇、95%乙醇）：

用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）。

（4）氯仿／异戊醇混合液（24：

1）：

将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24:

1）混合均匀后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。

（5）饱和酚：

从冰箱中取出-20℃保存的重蒸酚，待温度恢复至室温后，用68℃水浴融化，称取0.1g一羟基喹啉于250ml试剂瓶中，依次加入100ml重蒸酚，50ml超纯水，溶解混匀，4℃静置过夜，第二天用滴管把水分吸出。

（6）HCl-异丙醇标准溶液（0.1mol/L）：

称取9mL盐酸，用异丙醇稀释至1000mL，摇匀。

（7）DEPC水：

吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，剧烈震荡，放在棕色试剂瓶中静置4小时备用。

（8）Tris-HCl：

将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。

（9）0.5MEDTA（pH=7.5）：

在800ml蒸馏水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2·

2H2O）,充分搅拌，加NaOH调解pH值至7.5，定容至1L，高压灭菌。

（10）溴化乙锭溶液：

10mg/mL溴化乙锭：

100mg溴化乙锭加入10mL纯水中充分溶解，4℃储存。

（11）MgCl2：

在800ml水中溶解203.4gMgCl26H2O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。

（12）10％过硫酸胺：

将0.5g过硫酸胺加入到5mL双蒸水中。

（13）生理盐水：

氯化钠0.9克加蒸馏水水至100毫升。

（14）碘酒：

取碘化钾，加水20ml溶解后，加碘及乙醇，搅拌使溶解，再加水适量使成1000ml。

（15）培养液：

DMEM粉末12g，NaHCO33.8g，超纯水定容至1L，PH7.0－7.2，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

WilliamsE粉末12g，NaHCO33.8g，超纯水定容至1L，PH7.0－7.2，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

（16）初级毛囊的基础培养基：

：

WilliamsE培养基﹢L-谷氨酰胺2mmol/L﹢Hepes2mmol/L﹢氢化可的松10μg/L﹢牛胰岛素l0mg/L﹢亚硒酸钠10μg/L﹢庆大霉素4万单位/L。

（17）次级毛囊的基础培养基：

WilliamsE培养基﹢L-谷氨酰胺2mmol/L﹢Hepes2mmol/L﹢氢化可的松10μg/L﹢亚硒酸钠10μg/L﹢庆大霉素4万单位/L。

2.3.2实验仪器

-80℃超低温冰箱,SZX-ZP超净工作台（上海）,ScotsmanAF-100制冰机,79-1型磁力搅拌器（江苏）,FX-320型电子天平（日本）,QL-901旋涡混合器（江苏）,DYCZ-28D型电泳槽（北京市六一）,冷冻离心机（MicRo，MaxRF，美国IEC制造）,琼脂糖凝胶电泳系统（大连医科大学）,凝胶成像系统（美国冷泉港P41G型）,实时荧光定量RT-PCR仪（ThermoElectronCorporation公司Px2型）,Heraeussepatech-Biofuge28RS型超速离心机,VerticalSteriliiertsaoHsinth-3560型灭菌锅

3实验方法

3.1总RNA的提取

取初级毛囊培养基中的初级毛囊0.1g，液氮研磨后转入2mlTrizolReagent，4℃，13,500rpm离心5分钟后，匀浆后加入0．2ml氯仿，4℃，13500r／min离心15分钟然后吸取上清。

加入0．5ml异丙醇，4℃，13500r／rain离心10分钟然后弃上清，-20℃预冷75％乙醇洗沉淀，4℃，13,500rpm离心5分钟，用移液枪除去上清液，RNA溶于DEPC水。

琼脂糖凝胶电泳和以260nm及280nm吸光度值计算获得RNA含量及纯度。

3.2逆转录反应

逆转录操作按OmniseriptRT逆转录试剂盒提供操作说明书进行，所得cDNA放置-20℃保存。

次级毛囊中总RNA的提取及逆转录生成cDNA的操作同上。

3.3引物设计

按照GenBank已发布的绒山羊KAP7.1基因mRNA序列（登录号是AY310752）。

本实验选用的引物使用软件Primer5.0设计，由大连宝生物公司合成。

引物序列如下表所示：

表3-1KAP7.1基因的引物序列

Table3-1PrimersequencesofKAP7.1gene

KAP7.1基因

Markername

引物序列

Primersequences

上游引物序列

Forwardprimer

CTTGGCTCTCCCCTTGGTT

下游引物序列

Reverseprimer

CAGGTTGCTAAAGTTGCTTCCA

3.4实时荧光定量RT-PCR

PCR反应总体积为20µ

L：

SYBRPremixExTaqⅡ（2×

）10µ

L

PrimerF/R0.4µ

cDNA1µ

ddH2O8.2µ

Total20µ

PCR反应程序：

95℃预变性5分钟

94℃变性15秒

60℃退火（视引物不同而改变）30秒

72℃延伸30秒

40个循环

4结果与分析

4.1样品组织总RNA的检测

4.1.1毛囊兴盛期皮肤RNA

（1）电泳结果结果显示，从辽宁新品系绒山羊初、次级毛囊中提取出的总RNA较完整

ABC

图4-1毛囊兴盛期总RNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果

Fig4-1AgaroseofthetotalRNAinFollicledetectedPhoto

注：

A为次级毛囊提取RNA；

B为初级毛囊提取RNA；

C为DL2,000DNAMarker

（2）OD值结果显示，从辽宁新品系绒山羊初、次级毛囊中提取出的总RNA纯度较好，A260/A280约2.0左右，结果如下：

表4-1初次级毛囊总RNA的OD值检测结果

样本

A260

A280

A260/A280

浓度（ng/uL）

初级毛囊总RNA

3.512

1.707

2.06

276.94

次级毛囊总RNA

3.003

1.464

2.07

223.60

4.1.2毛囊退行期皮肤RNA

结果显示，从辽宁新品系绒山羊初、次级毛囊中提取出的总RNA较完整

ABC

图4-2退行期毛囊总RNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果

Fig4-2AgaroseofthetotalRNAinFollicledetectedPhoto

A为DL2,000DNAMarker，B为初级毛囊提取RNA，C为次级毛囊提取RNA

表4-2初次级毛囊总RNA的OD值检测结果

3.282

1.609

2.04

243.67

2.826

1.372

214.45

4.2RealTimePCR实验结果

4.2.1收集荧光信号

进行完实时荧光定量RT-PCR反应后，收集在反应中加入的荧光信号，将反应体系连入计算机软件进行图像和数据的分析。

扩增曲线即描述PCR动态进程的曲线，从图中可以看出，在扩增曲线的指数增长区域，重复性非常好，这对PCR的定量分析非常重要。

融解曲线分析是在PCR反应结束后，将PCR反应液的温度渐渐升高，实时监测SYBRGreenI的荧光信号强度变化进行的。

理想的融解曲线应该是只有单一峰形的曲线，由图可知，KAP7.1扩增时，融解曲线只有单一峰形，说明PCR扩增时没有引物二聚体等非特异扩增产生。

4.2.2兴盛期KAP7.1基因RT-PCR产物的扩增曲线及融解曲线分析

图4-3兴盛期Actin在初次级毛囊中的扩增曲

图4-4兴盛期Actin在初次级毛囊中的融解曲线

图4-5兴盛期KAP7.1在初次级毛囊中的扩增及融解曲线

4.2.3退行期KAP7.1基因RT-PCR产物的扩增曲线及融解曲线分析

图4-6退行期Actin在初次级毛囊中的扩增曲线

图4-7退行期Actin在初次级毛囊中的融解曲线

图4-8退行期KAP7.1在初次级毛囊中的扩增曲线图

图4-9退行期KAP7.1在初次级毛囊中的融解曲线图

RealTimePCR检测结果显示，内参基因（β-actin）和目的基因KAP7.1都得到了较好的扩增曲线和融解曲线，说明数据可信。

4.2.4KAP7.1基因在毛囊兴盛期和退行期初次级毛囊中的相对表达量

图4-10KAP7.1基因在毛囊兴盛期相对定量柱形图

图4-11KAP7.1基因在毛囊退行期相对定量柱形图

实验结果显示KAP7.1基因在兴盛期时，次级毛囊中的表达量高于在初级毛囊中的表达量，KAP7.1基因在次级毛囊中的相对表达量是初级毛囊的2.28倍，而退行期KAP7.1基因在初级毛囊中的相对表达量约是次级毛囊的1.11倍。

5讨论

利用实时荧光定量RT-PCR技术进行基因表达的测定是目前测定基因表达的常用方法之一。

实时荧光定量RT-PCR技术较之于以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。

首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。

其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性，并且无需在扩增后进行操作，而且由于扩增产物的检测在PCR扩增过程中同时进行，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测所需的时间比普通PCR要节省许多。

另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增[16-18]。

本实验以辽宁新品系绒山羊为材料，利用荧光定量RT-PCR技术，对角蛋白关联蛋白KAP7.1基因在新品系绒山羊初、次级毛囊中的表达进行比较分析，并研究其与经济性状（绒毛结构、绒毛品质、绒细度）的相关关系[19]。

我们的研究发现，在绒山羊初级毛囊、次级毛囊中均同时观察到内参照基因B-actin和目的基因KAP7.1的扩增曲线，说明KAP7.1基因在绒山羊初级毛囊、次级毛囊中均有表达，但在兴盛期，KAP7.1基因在次级毛囊中的表达量显著高于在初级毛囊中的表达量，