山西医科大学核医学分子影像综合服务平台Word格式.docx

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授课地点

教学目的

1、理解放射免疫分析的基本原理

2、理解非放射性标记免疫分析技术

3、了解常用的分析技术

重点难点

放射免疫分析的基本原理和应用

教学方法

多媒体

教学仪器

授课提纲

第一节放射免疫分析

第二节免疫放射分析

第三节非放射免疫分析

第四节体外分析技术的发展和现状

选用教材

《核医学》第八版李少林主编

参考教材

1.供8年制及7年制临床医学等专业用《核医学》，张永学主编，人民卫生出版社出版

2.《简明核医学》（第二版），潘中允主编，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社出版

教学步骤

第一节放射免疫分析

1.基本原理

2.基本试剂

3.质量控制

第二节免疫放射分析

2.实验方法

第三节非放射免疫分析

1.酶标记免疫分析

2.化学发光免疫分析技术

3.时间分辨荧光免疫分析

4.胶体金标记分析技术

思考题

1.放射免疫分析的基本原理是什么？

其与免疫放射分析的主要区别点有哪些？

2.放射免疫分析的基本试剂包括哪些？

要求分别是什么？

3.常见的非放射免疫分析方法有哪些？

讲授内容

注解

体外放射配体结合分析---指在体外条件下，以放射性核素标记的配体为示踪剂，以结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，对微量活性物质进行定量分析的一类检测技术的总称。

第一节放射免疫分析※

一、定义：

是利用标记抗原和非标记抗原竞争结合其特异抗体，给予充分的时间，使反应达到平衡，然后分离并分别测定结合的抗原抗体复合物放射性（B）和游离抗原放射性（F）来计算非标记抗原含量的一种超微量分析技术。

二、基本原理：

最具代表性的一类检测技术，是建立在抗原抗体结合的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的基础上的。

Ag＋Ab

AgAb

＋

*Ag

*AgAb

动态平衡体系中，*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力，当*Ag和Ab的量恒定，且Ag+*Ag的分子数〉抗体的分子数，*Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系。

图示：

剂量-标准抗原浓度

三、基本试剂

（一）抗体

1.RIA使用：

多克隆抗体和单克隆抗体

2.衡量抗体质量的指标是：

亲和力、特异性和滴度

（二）标记抗原*Ag的质量要求：

1.标记后不改变原有抗原的生物活性；

2.标记的放射性核素的t1/2不能太短；

3.比活度和放化纯度足够高，保证分析的灵敏度。

（三）标准品（标准抗原）

1.是已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，作标准曲线用。

2.要求：

保证与被测物具有相同的免疫活性和介质。

（四）分离方法

1.双抗体法

2.沉淀法

3.双抗体法+沉淀法

4.吸附分离法

5.固相分离法

（五）、放射性测量仪器

如用125I做标记，常用γ井型计数器对γ射线进行测量。

如用3H或14C做标记用液体闪烁计数器（liquidscintillationdetector）对β射线进行测量。

配以计算机系统对被测样品自动测量，数据处理和打印结果。

四、质量控制

（一）、目的：

保证分析误差控制在可接受的范围内

（二）、分类：

实验室内部质控和实验室间质控

（三）、误差的来源：

1、系统误差：

表现为结果呈倾向性偏高或偏低。

常见因素①方法误差：

如标准品稀释不正确，分离效果不好等②仪器和试剂：

仪器状态、量器、试剂纯度等③操作误差：

操作习惯、加错样品等。

通过努力系统误差可以消除。

2、随机误差：

表现为某一管或某一部分样本的结果误差随机的、偶然的，小误差的概率大。

常由操作者操作不当造成。

（四）、质量控制的指标

1、稳定性：

指RIA实验批间的重复性。

常用指标有：

1）零标准管结合率（B0%）：

一般要求在30-50%

2）非特异性结合率（NSB%）：

一般要求<

5-10%

3）标准曲线直线回归的参数

4）ED25、ED50、ED75

2、精密度：

是对某一样品多次检测所得结果的符合程度。

即复管的重复性。

是最重要的质量参数。

3、灵敏度：

方法的最小可测值。

计算方法是累计多批（一般10次）测量结果，计算出零标准管的结合率为x－2SD时对应的剂量值。

4、准确度：

是指测量值与真值的接近程度。

评价方法从回收率、质控样品和健全性三方面评价。

5、特异性：

取决于抗体的特异性，交叉反应越少，特异性越好。

免疫放射分析法是以125I标记抗体，用过量的标记抗体与待测抗原形成复合物，分离除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。

放射性标记的是抗体而不是抗原,且抗原与过量的标记抗体结合反应,故反应是非竞争性的全量反应。

三、常用实验方法：

双抗体夹心法、标记第三抗体法、双标记抗体法。

四、特点：

1、优点：

灵敏度较放免法。

2、局限性：

至少需要两个抗体；

对缓冲液PH及离子强度的要求较为严格；

待测抗原的量太大时，易出现“倒钩”现象。

第三节非放射免疫分析※

一、酶标记免疫分析技术

1、定义：

酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子，利用酶促作用使底物反应，利用酶使底物显色的作用而使酶的作用得到放大，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。

2、应用最多和最有发展前途的方法：

酶联免疫吸附分析法（ELISA）

3、常用的酶：

辣根过氧化物酶（HRP）

4、常用的底物：

四甲基联苯胺（TMB），反应后显黄色

氨基水杨酸（5-AS），棕色

5、常用方法：

固相测定法

6、测定方式：

分光光度计

7、化学发光酶免疫测定（CLIEA）抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同，不同之处是酶反应所用底物为发光剂发。

二、化学发光免疫分析技术

（一）化学发光免疫分析

1、用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物，其余类似RIA和IRAM.

2、发光化合物：

异鲁米那甲基氮蒽

3、缺点：

发光时间集中在加入过氧化物或碱的短时间内，必须严格掌握时间。

（二）化学发光酶免疫分析（CLEIA）

1、标记物：

碱性磷酸酶的抗体

2、底物：

金刚烷

3、优点：

可靠性好

（三）电化学发光免疫（ECLI）

标记物：

三联吡啶钌

三、时间分辨荧光免疫分析技术

1、镧系元素铕（Eu）铽（Tb）钐（Sm）镝（Dy）并非荧光素，但由于特殊的理化性质，在离子价态时受到紫外光或激光的激发后会以荧光形式发射持续一定时间、一定光峰光谱，而其他非特异荧光寿命短，利用时间分辨可排除背景荧光的干扰。

2、常用方法：

双位点夹心法、BAS增强双位点夹心法、相抗原竞争法、固相抗体竞争法

3、优点：

提高了灵敏度，不损害样品而可以重复测量或做其他测量；

高度自动化。

四、胶体金标记分析技术

继放射性核素、荧光素和酶标技术之后的又一种新的标记技术，它以胶体金为标记物，应用于免疫化学或免疫分析中，对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。

1.历史建立：

60年代由Yalow和Berson等偶然观察到125I标记的胰岛素与胰岛素抗体的结合与体系中存在的非标记胰岛素的量呈一定的相关性。

从而建立了放射免疫分析法。

2.发展：

放射免疫分析——非放射免疫分析

3.优点：

灵敏度高，操作简便，成本低

课堂小结：

1、RIA的基本原理要点:

*Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系.

2、RIA的特点：

★灵敏度高

★特异性强

★精确度好

★稳定性好

★应用广泛

3、免疫放射分析：

4、非放射性标记免疫分析技术：

全自动化，有效地解决了大规模临床样本检测的稳定、高效、快速、自动化问题。

是医学超微量分析的一次战略性革命。

理解

放射免疫分析是一划世纪的进步，1977年荣获诺贝尔生物医学奖。

竞争放射分析原理示意图：

了解

手绘图：

板书+手绘图：

精确性问题是随机误差问题，而偏差是系统误差问题