《环境微生物的检测与分析》实验指导0113要点文档格式.docx

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其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气性、pH有关。

例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。

本实验以肥沃的菜园土为实验材料分离土壤中的好气性细菌、放线菌和霉菌，并进行数量测定。

分离微生物常用的方法有：

稀释涂平板法、稀释混合平板法、划线分离法等。

根据不同的实验材料可以采用不同的分离方法。

其最终目的是在培养基上出现欲分离的微生物的单个菌落，必要时再对单菌落进行进一步的分离纯化。

本实验分离细菌时采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、分离放线菌时采用高氏一号琼脂培养基、分离霉菌时采用马铃薯蔗糖琼脂培养基。

稀释平板计数法是根据微生物在固体培养基上一个活的单细胞繁殖能形成一个菌落这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个活的单细胞。

计数时，首先将待测样品制成一系列稀释液，再取一定稀释度，一定体积的稀释液接种到平板中，使其均匀分布到平板中的培养基内。

经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，根据稀释倍数即可计算出样品中的含菌数。

由于此方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。

一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品的检定，生物制品检验，土壤中可培养微生物含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验等方面。

拮抗作用是微生物之间普遍存在的一种相互关系。

它是某些微生物生命活动中产生的一种特异性代谢产物─抗生素，具有抑制或杀死另一些微生物的作用。

能产生抗生素的微生物称为抗生菌。

平板对峙法常用于拮抗菌对离体植物病原菌的拮抗作用的测定。

其原理是，把抗生菌与供试病原菌同时置于同一培养基平板上，由于抗生菌对病原菌的拮抗作用，抗生菌菌落边缘与病原菌菌落边缘之间会产生一定的抑菌距离。

抑菌距离越大，拮抗作用越强。

组织法常用于拮抗菌对活体植物病原菌的拮抗作用的测定，也可用于化合物的活性测定。

其原理是把抗生菌所产生的抗菌物质预先接种于即将发病的植物组织上或接种在已发病的植物组织上，由于抗生菌所产生的抗菌物质对病原菌的拮抗作用，病原菌无法致病或延缓病原菌的致病作用。

三、实验材料

1、器材：

电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。

2、试剂和材料：

无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·

3H2O、MgSO4·

7H2O、FeSO4·

7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。

四、实验步骤

（一）培养基的配制

（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培养基

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。

配方如下：

牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g水1000mLpH7.4-7.6

1、称量药品

按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入搪瓷缸中。

牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入搪瓷缸。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2、加热溶解

在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入锅中，在电磁炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。

若配制固体培养基，则需先调pH值后再溶解琼脂，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。

3、调pH

用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/LNaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。

若偏碱，则用1mol/lHCL进行调节。

pH调节通常放在加琼脂之前。

注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4、过滤

液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。

5、分装

按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量：

固体培养基约至试管高度的1/5；

分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。

6、加棉塞

试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。

棉塞的形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。

有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。

有时也可用试管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。

7、包扎

加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外包一层牛皮纸。

然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8、灭菌

将上述培养基于121摄氏度湿热灭菌30min。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9、摆斜面

灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；

待其凝固，

10、无菌检查

将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。

或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（2）、配制高氏一号培养基

高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。

可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO4·

7H2O0.5gFeSO4·

7H2O0.01g琼脂20g蒸馏水1000mLpH7.4~7.6

1、称量和溶解

先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少许少量少于所需的水量，放入锅中在电磁炉上边加热边搅拌，至其完全溶解。

对微量成分FeSO4·

7H2O可先配制成高浓度的储备液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4·

7H2O，配成0.01mg/ml的储备液，再在1000ml的培养基中加入以上储备液0.1ml即可。

待所有的药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如果要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同上。

（3）配制马铃薯蔗糖培养基

马铃薯蔗糖培养基是用于分离真菌的选择培养基。

去皮的马铃薯200g蔗糖20g琼脂20g蒸馏水1000mL，自然pH

1、称量和溶解

先计算后称量，按用量称取各成分。

将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少于所需的水量在电磁炉上加热20min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。

2、同

（2）2

（二）制备土壤稀释液

（1）取土壤

取表层以下5~10cm处的土壤样品，放入灭菌的牛皮纸袋中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。

（2）土壤预处理及保存

将采集的样品带回实验室平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并检出植物根、茎、叶及石块等杂物，约20号筛筛分。

土壤处理好后备用，或放在4摄氏度冰箱暂存。

（3）制备土壤稀释液（要无菌操作）

1、制备土壤悬液

取土样5g，迅速倒入带玻璃珠的45mL无菌三角瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），置摇床中振荡5~10min，使土样充分打散，即成10-1的土壤悬液。

2、稀释

用无菌移液管吸10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中，震荡混匀即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-2~10-9的稀释液。

注意：

操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

（三）混菌测定菌落数的方法

1、细菌

取10-7，10-8，10-9三管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平培养皿中，每个稀释度接三个培养皿。

然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满培养皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动培养皿，使菌液与培养基充分混均，但不沾湿培养皿的边缘，待培养基凝固即成细菌平板，倒平板时注意无菌操作。

2、放线菌

取10-4，10-5，10-6三管稀释液，在每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从三管吸出1ml加入相应标号的培养皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成放线菌平板。

3、霉菌

取10-1，10-2，10-3三管稀释液各1ml，分别接入相应的培养皿中，每个稀释度接三个平皿。

在溶好的马铃薯蔗糖固体培养基中，每100ml加入灭菌的乳酸1ml，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成霉菌平板。

将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即培养皿盖朝下放置，于28~30摄氏度恒温培养，细菌培养1~2d，放线菌培养5~7d，霉菌3~5d。

可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。

（四）稀释倒平板法测定菌落数的方法

1、倒平板

将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基分别放入微波炉中熔化，将熔化好的培养基冷却至50摄氏度至超净工作台中倒入灭菌好的培养皿中，待冷却后编号备用。

2、吸取土壤稀释液

用无菌吸管吸取取10-7，10-8，10-9三管土壤稀释液各0.1mL对号接种在不同稀释度编号的牛肉膏蛋白胨培养基平板上。

每个编号设3个重复，用于分离细菌。

用无菌吸管吸取取10-4，10-5，10-6两管土壤稀释液各0.1mL对号接种在不同稀释度编号的高氏一号培养基平板上。

每个编号设3个重复，用于分离放线菌。

用无菌吸管吸取取10-1，10-2，10-3两管土壤稀释液各0.1mL对号接种在不同稀释度编号的马铃薯蔗糖培养基平板上。

每个编号设3个重复，用于分离霉菌。

3、涂布平板

用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。

在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。

将涂抹好的平板平放于桌上20~30min使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养。

注：

无菌操作要点

火焰消毒：

在无菌环境中进行培养或进行其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。

以后所有的操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都要在火焰附近操作并经过灼烧进行。

但要注意：

金属器械不能在火焰中灼烧时间过长，以防退火，烧过的金属要待冷却后才能夹取物品，以防造成物品损伤。

吸过营养液的吸管不能再次进行灼烧，因残留在吸管中的营养液能被烧焦成碳膜，再用时会把有害物带入培养液中。

开启、关闭长有微生物的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止温度过高烧死细胞。

另外，有橡胶塞的试管也不能灼烧时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养的微生物。

无菌操作：

进行无菌操作前用75%的酒精擦拭超净工作台面及双手。

进行无菌操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。

不能用手触及已经消毒的物品，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。

为了拿取方便，工作台面上的东西要有合理的布局，原则上应将右手使用的东西放在右侧，左手使用的东西放在左侧，酒精灯放在中央。

工作由始至终要保持一定的连续性，组织和细胞在未做处理前，勿过早暴露在空气中。

同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；

如果用过之后不再重复使用，应立即封闭瓶口直立。

吸取各种液体时，均应分别使用吸管，吸管不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。

工作中不能向操作台面讲话或咳嗽，以免细菌或支原体带入工作台面发生污染。

（五）平板菌落计数

按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克土壤中的含菌数。

1、同一稀释度各个重复的菌落数相差不太悬殊。

2、细菌、放线菌以每培养皿30~300个菌落为宜，霉菌一每培养皿10~100个菌落为宜。

3、选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。

混合平板计数法：

每g土壤样品含菌数=同一稀释度3次重复的菌落平均数×

稀释倍数

稀释倒平板计数法：

10×

未知菌判断要点

细菌菌落特征：

细菌菌落大小不一，小的不到1mm，大的可以铺满整个培养皿；

菌落形状有圆形、不规则形、卷发状、假根状等；

菌落的隆起形状有扩展、台状、低凸、乳头状等；

有点菌落有光泽，有的没有；

有的菌落较粘，有的较脆；

菌落一般呈白色，少数为灰色、黄色、红色、绿色和棕色等。

放线菌菌落特征：

放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状、或坚实、干燥而多皱。

由于基内菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合紧密，不容易被挑起，或被挑起后不容易被破碎。

当孢子丝形成大量的孢子而不满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。

此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。

霉菌菌落特征：

霉菌菌落形态较大，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状；

菌落与培养基间的连接紧密，不易挑取，菌落正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心的颜色、构造常不一致等。

由于霉菌的细胞呈丝状，在固体培养基上生长时又有营养菌丝和气生菌丝的分化，而气生菌丝间没有毛细管水，故它们的菌落与细菌、酵母菌的不同，较接近放线菌。

（六）拮抗菌的筛选——平板对峙法

1、真菌与细菌

（1）NA培养基平板的制备：

待NA培养基熔化后，冷却至手摸不烫时，取10mL刻度试管，趁热倒入培养基至10mL刻度，立即倒入9cm的培养皿中，制成厚薄均匀的培养基平板，备用。

（2）细菌接种：

在无菌条件下，从分离的平板中接种细菌培养过夜、备用。

（3）真菌接种：

用4mm打孔器从分离的平板上打制菌饼，然后将菌饼面朝下紧贴于PDA培养基接种到培养基平板一侧，然后加盖并标记（操作要迅速准确，菌饼放下后就不能够再移动）。

于适宜温度（一般为25~28摄氏度）的培养室或培养箱中黑暗培养。

（4）结果检查：

培养5~7天后，取出PDA平板，用卡尺测量真菌菌落和细菌菌落边缘之间的抑菌距离，单位为毫米（mm）。

2、真菌与放线菌

（1）高氏一号培养基平板的制备：

待高氏一号培养基熔化后，冷却至手摸不烫时，取10mL刻度试管，趁热倒入培养基至10mL刻度，立即倒入9cm的培养皿中，制成厚薄均匀的培养基平板，备用。

（2）放线菌接种：

在无菌条件下，从分离的平板中接种放线菌培养2~3天，备用。

培养5~7天后，取出PDA平板，用卡尺测量真菌菌落和放线菌菌落边缘之间的抑菌距离，单位为毫米（mm）。

3、细菌与放线菌

（1）细菌菌悬液的制备：

对分离得到的细菌，接种到NA液体培养基中，培养过夜，备用。

（2）高氏一号培养基平板的制备：

（3）细菌接种：

在无菌条件下，将制备好的细菌菌悬液涂布到高氏一号培养基平板，备用。

（4）放线菌接种：

在无菌条件下，从分离的平板中接种放线菌与上述平板中央，然后加盖并标记。

培养2~3天后，取出平板，用卡尺测量细菌菌落和放线菌菌落边缘之间的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）。

（七）拮抗菌的保藏——短期保藏

对具有拮抗作用的细菌、放线菌、真菌分别接种到NA培养基平板、高氏一号培养基平板、PDA培养基平板，经培养后存放于4℃冰箱保存（保藏期限1~3个月），备用。

五、注意事项

1、称量药品后应做好标记，勿与其它药品混在一起，称完药品应及时盖紧瓶盖。

2、注意pH值不要调过头，以免影响培养基内各离子的浓度。

3、应用记号笔在相应的位置注明培养基的名称、组别和日期。

4、放线菌的生长时间比较长，故制作平板时，培养基的量应多加一些。

5、观察菌落特点时应选择分离的较开的很大的菌落，对培养基和试管要编好号码，不要随意移动开盖，以免搞混菌号获受到污染。

6、实验完成后，应即时对实验数据进行收集、处理。

7、在利用平板对峙法分析真菌与细菌、真菌与放线菌之间是否有拮抗作用时，接菌后菌丝块勿移动。

六、结果分析

1、对菌落数进行观察记录，填入下表。

并计算每克土壤中不同种类微生物的数量，并与理论值进行比较分析。

培养基

天

浓度

第一天

第二天

第三天

第四天

第五天

第六天

PDA

10-1

10-2

10-3

高氏一号

10-4

10-5

10-6

NA

10-7

10-8

10-9

2、平板对峙法结果分析

记录实验结果，分析真菌与细菌、真菌与放线菌之间是否有拮抗作用？

七、思考题

1、固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？

2、培养基中加琼脂的作用是什么？

3、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？

4、如何检查培养基灭菌是否彻底？

5、平板培养时为什么要把培养皿倒置？

6、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？

7、总结几种接种技术的要点及注意事项。

8、分离不同类群的微生物为何要选不同的稀释度？

9、稀释平板分离测数法与血球计数板测数法各有何优缺点？

10、何为拮抗作用？

举例说明微生物与微生物之间的拮抗关系。

实验二拮抗菌的鉴定与保藏

1、掌握微生物菌种鉴定的常规方法。

2、掌握微生物菌种的保藏方法。

微生物菌种鉴定对于更好的认识和利用微生物菌种具有重要的理论和实践意义。

目前常用的菌种鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性鉴定、BIOLOG碳源自动分析鉴定、分子生物学鉴定、API细菌数值鉴定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄层层析、全细胞脂肪酸分析鉴定、（G＋C）mol％测定、DNA/DNA同源性测定等。

（1）常规鉴定

常规鉴定内容有形态特征和理化特性。

形态特征包括显微形态和培养特征；

理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。

（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定

BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。

通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。

（3）分子生物学鉴定

应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。

可采用核酸序列分析法分析细菌16SrDNA/16S-23SrDNA区间序列、酵母18SrDNA/26SrDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18SrDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列。

（4）API细菌数值鉴定系统

API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。

鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。

（5）功能性分析及功能基因

目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。

应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。

（6）RAPD、SSCP技术

采用随机扩增多态性DNA（RandomlyamplifiedpolymorphismDNA，RAPD）技术和单链构象多态性（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。

如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；

采用SSCP技术进行工业酒精酵母菌株的鉴别，此技术结合菌株发酵特性，在酒类生产的质量控制方面起到积极作用

（7）TLC薄层层析

TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定，进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析（氨基酸、糖），作为划分属特征的重要鉴定技术手段，起到了良好的辅助作用。

（8）全细胞脂肪酸分析鉴定系统

采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对，来鉴定细菌及酵母。

该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效手段之一。

（9）（G＋C）mol％及DNA/DNA杂交

采用DU800核酸蛋白分析仪测定Tm值，从而得到微生物菌株的（G＋C）mol％，并与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析，该鉴定技术手段是多相鉴定的重要组成部分。

无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、