鸡蛋中溶菌酶的提取文档格式.docx
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[1][2]
溶菌酶来源广泛,人、动物、植物和微生物中均有发现,其中鸡蛋清中含量较高,因此,工业生产溶菌酶常以鸡。
蛋清为原料鸡蛋清的溶菌酶是研究得最清楚的一种溶菌酶[3]，其化学性质稳定，纯品为白色或微黄色结晶体，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇，是一种分子量在14～15kD，等电点pH值在左右，最适效应温度在50℃，最适pH值为～的碱性球蛋白。
它的生物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。
溶菌酶的抗菌及抗病毒活力与pH值有关，在酸性介质中，活力显着增强。
当前,溶菌酶的制备有多种方法，最常用的是离子交换树脂吸附法[4]。
溶菌酶的用途很多，由于它本身是一种天然蛋白质，无毒性，可以作为防腐剂、保鲜剂。
在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，广泛应用于临床医学。
溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取，在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于破坏细胞壁，制备无菌提取液。
溶菌酶所具有的广泛用途吸引了国内外众多学者对其进行研究，已发表不少关于溶菌酶的试验报道。
1材料和方法
材料与仪器
新鲜鸡蛋3颗,购自市场；
724型酸性阳离子交换树脂；
灭菌纱布；
1mol/LNaOH，1mol/LHCl；
蒸馏水（实验室桶装水）；
磷酸缓冲液（pH，）；
10％（NH4）2SO4溶液；
固体（NH4）2SO4；
BaCl2；
12﹪分离胶；
4﹪浓缩胶；
Tris-甘氨酸电极缓冲液；
loadingBuffer；
标准蛋白Marker；
染色液（考马斯亮蓝G-250）；
脱色液（冰乙酸，甲醇）；
葡聚糖凝胶（SephadexG-75）；
蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）；
G-75洗脱液（KCl，HAc）
电子分析天平；
真空泵；
超声振荡器；
布氏漏斗，循环水式多用真空抽滤泵；
玻璃棒，冰水浴，吸管，普通离心机，高速冷冻离心机；
透析袋，磁子，磁力搅拌器，玻璃层析柱（20mm×
15cm），恒流泵，细滴管，Bio-Rad层析系统设置，部分收集器；
水浴锅；
Bio-Rad垂直电泳系统（制胶系统、电泳槽）；
脱色摇床；
可见分光光度计（UV-1100型）；
紫外分光光度计；
微量移液器；
4℃冰箱；
容量瓶；
精密pH试纸；
等。
部分试剂详细配方及配法见附录I
实验方法
阳离子交换法提取溶菌酶
树脂预处理：
干树脂清水浸泡，使其充分膨胀并除去细小颗粒和较大杂质；
1mol/L的HCl浸泡2h，去离子水洗3次至至近中性；
抽滤收集树脂,1mol/L的NaOH溶液浸泡2h，去离子水洗3次至近中性；
抽滤收集树脂,加mol/L、pH值为6．5的磷酸缓冲液平衡过夜待用。
蛋清制备：
将3个新鲜鸡蛋洗净干燥，小端敲一个小洞，大端打一个小孔进气，分离得鸡蛋清，用1mol/LHCl调节PH到7。
过滤前称量烧杯重，缓慢搅拌用灭菌的两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，蛋清与烧杯总重，蛋清净重。
用1mol/L的HCl溶液调pH值至，量蛋清体积为100ml。
在调节PH时蛋清中出现少量白色沉淀，可能为部分蛋白由于局部过酸而变性。
吸附：
蛋清在不断搅拌下加入抽滤好的724树脂25g（相当蛋清四分之一体积的树脂），冰水浴中磁力搅拌器缓慢搅拌（使树脂全部悬浮在鸡蛋清中，搅拌不能起泡）吸附h，4℃静置。
然后3000r/min离心15min分层，收集树脂，回收蛋清（留样A）。
去除杂蛋白：
收集树脂用去离子水振荡水洗直至洗液澄清（至无白沫为止），吸管轻吸去洗液，以去除杂蛋白。
（每洗1次，离心1次，总共3次）冰浴中用等体积的L、pH=的磷酸缓冲液搅拌洗涤15min，抽滤，重复洗三次，注意防止树脂流失。
最后一次抽滤滤除树脂水分至干燥。
洗脱溶菌酶：
树脂中加入35ml（等体积）的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30min，抽滤,使溶菌酶从树脂上洗脱下来，重复两次，合并收集洗脱液（留样），洗脱液过滤后，准确量取体积100ml。
（留样B）
盐析:
每83mL洗脱液加32g磨细的固体（NH4）2SO4，本实验中总量为。
缓慢加入（NH4）2SO4搅拌待完全溶解后保鲜膜封口，置于4℃冰箱盐析过夜。
透析:
待白色沉淀析出，3000r/min离心15min，收集沉淀，用去离子水将沉淀洗下并全部溶解（去离子水），装于透析袋中，于去离子水中透析（冰浴），期间2次更换去离子水，直至用BaCl2检测透析完全。
透析装置中加入磁子，于磁力搅拌器中搅拌加快透析速度。
去杂质蛋白：
取出透析袋中的透析液，用LHCl调整，产生少量白色沉淀（留样D），可能为杂蛋白。
3000r/min离心10min，收集上清液（留样C20ul）。
浓缩：
用PEG-20000浓缩上清液至（留样E，20ul，加loadingbuffer,出现黄色（可能为浓缩时透析袋中渗入了PEG-20000）。
[5][6]
凝胶溶胀及预处理:
取足量SephaexG-75于烧杯中加入20倍体积洗脱液，置室温溶胀2天。
反复倾泻去掉细颗粒，并泵脱气；
洗脱液用超声脱气完全。
测柱床总体（Vt）：
取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
在距柱上端约3cm处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接住柱中去离子水（水面降至层析玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt=ml。
装柱：
在柱中注入已脱气洗脱液（约1/3柱床高度），将溶胀好的凝胶与洗脱液1：
3混匀稀释后缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，常压平衡，胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。
然后关闭出水口，静置过夜，等凝胶完全沉降。
过夜后的凝胶柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，连接处无死体积。
预加样：
在胶面上覆盖一层滤纸，接恒流泵，用2倍床体积的洗脱液以min流速平衡柱子，使柱床稳定，期间测定流速是否与预设的一样，并赶走系统中的气泡。
用另一支相同的层析玻璃管与层析柱对比得到外水体积为。
吸去柱上端的洗脱液，打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（不要干胶），关闭出水口。
用细滴管吸取mL蓝色葡聚糖-2000沿管壁缓慢加入，打开出水口，等蓝色葡聚糖渗入胶床与胶面相切时，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，柱上端再用洗脱液充满后用min的速度开始洗脱。
收集洗脱液没管ml。
手动记录时间与对应的OD280并绘制曲线。
葡聚糖色带狭窄、均匀平整，层析柱性能良好。
蓝色葡聚糖洗下来之后，用洗脱液（1倍床体积）继续平衡一段时间。
加样和洗脱：
按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶样品溶液mL，用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件，以约min的速度洗脱并收集洗脱液每管ml。
手动记录时间及检测到的洗脱液在A280nm处的吸光值。
将收集管编号置于4℃冰箱保存.合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液。
（预先测得记录仪至部分收集器的死体积，出现峰值处的收集管延迟死体积所占的管数才为峰值处样品。
）
制胶：
电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。
将12%的分离胶加入到电泳槽内的两玻璃板之间，到上口约3cm止，再加一薄层蒸馏水填满，赶走气泡，水与胶面分开并且界面清晰。
静置20min，将水倒去。
将4%的浓缩胶连续平稳加入至刚刚没过薄板，赶走气泡。
迅速从左至右插入梳子，不要留下气泡，静置30min。
（取下胶版放入PE手套，加适量蒸馏水4℃保存）
点样：
将样品与loadingBuffer1:
1混匀。
将上述处理的各级分样品和蛋白Marker分别加到点样槽中5ul。
接通电源先恒压130V电泳，待各样品从浓缩胶进入分离胶后恒压220V继续电泳，直到溴酚蓝距凝胶边缘5mm是停止电泳，关闭电源。
染色及脱色：
电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，小心用塑料板开启电泳厚板和薄板，使胶片完整取下。
用塑料板切去浓缩胶部分，分离胶放入大的培养皿用考马斯亮蓝R-250摇床染色20min,回收考马斯亮蓝R-250，在培养皿中加脱色液脱色过夜（期间多次更换脱色液直至背景清楚，条带清晰），并对电泳图谱拍照记录。
采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。
[7]先用牛血清清蛋白（BSA）及考马斯亮蓝G-250制作蛋白质标准曲线，再根据标准曲线回归方程计算目的蛋白浓度。
附：
具体组分加样量见附录II
2结果和分析
凝胶层析纯化
图1和图2分别为蓝色葡聚糖和蛋白样品的凝胶层析洗脱图谱。
图1层析条件流速min,每2min收集一管。
曲线呈明显的尖峰，而且范围狭窄，说明层析柱性能很好。
OD280在7、8、9号管出现峰值，根据收集管颜色判断9、10、11号管为峰值，由此推断从经过紫外检测器测得OD值到由部分收集器收集到该样品推迟体积为2ml。
图1蓝色葡聚糖凝胶层析洗脱图谱
图2上可以看出，在样品峰值之前有其他的杂蛋白洗脱出来，可能为清蛋白、朊蛋白或PEG浓缩时混入的PEG。
在层析过程中第25分钟时出现重大失误，发现凝胶柱干裂，停止洗脱，虽然记录到峰值，但由于存在2ml延迟，未收集到峰值处洗脱液，只收集到第19和20min的洗脱样品（24和25号管收集液,），该处样品处于多个蛋白洗脱峰之间，由此推断成分复杂，目的蛋白不纯。
图2蛋白样品凝胶层析洗脱图谱
蛋白质纯度
图3和图4分别为凝胶层析纯化之前和之后的SDS-PAGE电泳图谱。
图3中由于留样A（树脂吸附后蛋白上清液）浓度太大并可能部分发生凝固，且未稀释，影响了蛋白Maker及其他样品泳道的效果。
但仍然可以分辨出蛋白Maker的六条带，最下面一条为溶菌酶的条带，分子量为14．3kD。
对应的4号和6号泳道蛋白样品中分离得到的溶菌酶的条带颜色较深，证明粗提取得到了浓度较高的溶菌酶，但含有大量杂蛋白，主要为卵清蛋白（45kD）、卵白蛋白（kD）及其他杂蛋白，还含有少量的PEG（处）。
留样A显然含有大量杂志蛋白，分子量主要分布在到kD之间。
从图4可以看出，6号和7号泳道的第19和20min的洗脱样品即24和25号管收集液，因为处于杂蛋白峰值和溶菌酶峰值之间，成分复杂，显然是不纯的，主要有两条带，除溶菌酶外还有少量卵清蛋白。
8号泳道为借用其他组较好的层析后样品，可以看出纯化效果较好，五杂蛋白。
9号泳道的留样A稀释100倍后电泳效果较好，主要成分为杂蛋白。
两图中杂蛋白样品的条带中也有少量溶菌酶，证明溶菌酶在每一步都会不可避免的损失。
随着纯度越高，得率越低。
条带颜色的深浅一方面与酶浓度有关，另一方面与染料的选择及浓度和染色时间有关，一般染料浓度越高，染色时间越长，染色越深，但脱色也更难。
在本试验中，加样量在5μL左右、固定染色20min比较合适，脱色时在摇床上洗脱过夜效果最好。
图3溶菌酶产品的SDS-PAGE电泳图谱
1.标准蛋白Marker
2.留样A（未稀释）树脂吸附后蛋白上清液
3.留样B?
10％（NH4）2SO4溶液洗脱树脂的洗脱液
4.留样C?
透析液去杂蛋白离心后的样品
5.留样D?
透析液调节PH至后产生的白色杂蛋白
6.留样E?
PEG浓缩后的样品
图4层析后溶菌酶产品的SDS-PAGE电泳图谱
2.留样B10％（NH4）2SO4溶液树脂的洗脱液
3.留样C透析液去杂蛋白离心后的样品
4.留样D透析液调节PH至后产生的白色杂蛋白
5.留样EPEG浓缩后的样品
6.层析24号管收集样品
7.层析25号管收集样品
8.其他实验小组层析较好的收集样品
9.留样A（稀释100倍）树脂吸附后蛋白上清液
蛋白质浓度
图5所示为蛋白质标准曲线，相关系数R达，表明线性关系较高，符合实验要求。
利用此标准曲线可计算样品的溶菌酶浓度、得率等。
图5?
蛋白质标准曲线
提取的蛋白样品稀释10倍后的OD595=，代入回归方程得到该蛋白样品浓度为ml。
由此计算蛋清中溶菌酶的得率为：
ml×
得率=__________________________=100ml
100ml
但据参考文献，蛋清溶菌酶提取率可达100ml。
[5]但采用本实验的提取方法,实验的酶得率非常低。
可能原因是离子交换剂选择的不同，提取个步骤中损失较多。
张文会等使用将D125阳离子交换树脂的Na+型、H+型混合，本实验使用724型酸性阳离子交换树脂，吸附能力可能存在一定差异。
在粗提取中用1mol/L的HCl调节PH时局部过酸使部分溶菌酶变性凝固；
在蛋清的树脂吸附使用磁力搅拌而不是手动搅拌，影响了吸附效果，电泳结果显示有微量的溶菌酶残留在蛋清上清液中；
在去除杂蛋白的过程中流失了少量树脂也损失了溶菌酶；
其他个步骤中都有少量含溶菌酶的溶液残留在容器壁上，造成溶菌酶损失。
3讨论
树脂吸附
实验后得知在阳离子交换层析吸附过程中,不能用磁力搅拌器搅拌,需要手动搅拌,且不能搅动太快，不能出现泡沫。
因为磁力搅拌器是靠摩擦力搅拌,易将树脂打碎,影响溶菌酶的吸附效果。
本实验吸附过程使用了磁力搅拌器搅拌，对实验造成了影响，直接影响了溶菌酶的得率。
调节PH及盐析
在用调节蛋清PH时使用了1mol/l的HCl，可能酸度过高滴加速度过快，导致了部分蛋白局部过酸变性，影响的得率。
吸取这次教训，在用硫酸铵固体盐析溶菌酶之前，要把硫酸铵固体结晶研磨成细微的粉末状，加入时要缓慢加入，不断搅拌防止局部盐度过高导致蛋白局部变性。
由此可见，在提取蛋白过程中加入任何溶液或固体都要极缓慢的加入，并且搅拌，防止局部浓度过高对蛋白活性产生影响。
透析与浓缩
因为洗脱溶解蛋白样品时没能控制好蒸馏水用量，且透析过程使样品溶液体积进一步增加，因此用PEG-20000浓缩蛋白样品。
可能是由于透析袋没有扎紧或透析袋本身的问题，PEG-20000进入到透析袋，与蛋白样品混在一起，这样必然影响目的蛋白的纯度并可能影响溶菌酶的活性。
溶菌酶凝胶层析
本实验凝胶层析中凝胶柱是自己手动填充的，这一步非常重要，装柱的质量直接关系到分离样品的成败。
柱子应固定在稳定的支架上,并保证其垂直，同时需寻找合适体积的洗脱液与凝胶灌入柱中，注意不能出现断层现象，再经常压平衡过夜，加压平衡2小时，用蓝色葡聚糖-2000检验，蓝色色带狭窄均匀，才算顺利制备出凝胶柱。
本实验凝胶柱制备非常成功，凝胶柱性能良好。
层析过程所用的洗脱液一定要超声脱气1小时以上，脱气后不要震荡，不要倾倒混合，一面在此混入气体，已脱气的要用保鲜膜封口，以免混入杂质。
层析系统的入口管要保证完全没入洗脱液。
实验最大的遗憾是在样品层析时发生凝胶柱干裂，虽然已记录到峰值，但由于体积延迟未收集到峰值处电泳纯的样品。
分析原因可能是系统接口处漏气，凝胶柱产生负压而进入空气。
当时两名同学忙于记录数据及收集样品，未及时发现问题。
这是一次深刻的教训，任何实验中如果出现一点差错，就可能前功尽弃，
SDS-PAGE电泳
电泳是本实验的眼睛，用来检测每一步骤中样品是否存在，纯度如何，以及去除的杂蛋白成分如何，多条电泳条带进行多重、两两比较、横向及纵向比较，帮助分析提取效果，凝胶层析纯化及蛋白质得率。
出现问题可以从电泳图谱上寻找问题的根源。
电泳过程中还要注意的是点样的蛋白样品的浓度。
如果浓度较大的样品需要适当稀释，如本实验留样A浓度较大，第一次电泳是未稀释，导致泳道拥挤，影响了整个胶版上其他的泳道。
第二次电泳把留样A稀释了100倍，得到较好的电泳图谱。
还要注意如果蛋白样品已大量发生凝固，不能通过电泳分析纯度，因为凝固的蛋白无法在胶版内运动。
实验心得
从以上分析看出本次实验前面大部分都很顺利，只是最后层析结果令人遗憾。
总体上还算成功，在实验组人员较少，每天平均2-3个人的情况下作出这样的成果实属不易。
当然这也部分归功于前期准备较充分，人员安排恰当，节省了等待时间。
从实验准备、实验操作到实验总结我都全程参与，既要从宏观上把我整个实验，又要从细节上弄清每一步的实质，这对我来说是一个很好的锻炼。
参加实验的同学从中学到了很多东西，实验技巧得到提升，也明白了任何实验不会一帆风顺，需要实验者不断地探索。
同学之间关系更加融洽，团结，协调，充满着科研的氛围。
身为本实验小组组长我倍感欣慰。
参考文献
[1]荣晓花,凌沛学.溶菌酶的研究进展.中国生化药物杂志,1999,20（6）:
319-320.
[2]朱奇,陈彦.溶菌酶及其应用.生物通报,1998,33（10）:
9-10.。
[3]梅丛笑,方元超.溶菌酶及其在茶饮料生产中的应用前景.天津轻工业学院学报,2002
（2）:
19-21
[4]马美湖.我国蛋与蛋制品加工重大关键技术筛选研究报告.中国蛋品科学大会,2004:
6.
[5]张文会，王艳辉，马润宇.离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶.食品工业科技，2003，6：
57-59.
[6]于滨，迟玉杰.高活力蛋清溶菌酶制备技术的研究.农产品加工,2006（4）:
4-6,11
[7]魏群.基础生物化学实验，129-131?
附录
附录I?
部分试剂配制方法
1、磷酸缓冲液（，）：
称取NaH2PO4和Na2HPO4，分别溶解混合后定容至1L。
2、分离胶及浓缩胶配置
加样胶浓度
ddH2O
Arc-Bis（30﹪）/ml
Tris-HCl缓冲液（PH=/ml
Tris-HCl缓冲液（PH=/ml
SDS（10﹪）/ml
APS（10﹪）/ml
TEMED/ml
12﹪分离胶
2
4
---
4﹪浓缩胶
3、Tris-甘氨酸电极缓冲液：
5×
Tris-GlyBuffer稀释5倍后使用。
Tris-GlyBuffer：
加样
Tris
Gly
SDS
加量
15g
72g
5g
定容至1L
4、G-75洗脱液：
称取KCl和HAc，分别溶解混合后定容至1L。
5、10%（NH4）2SO4：
称取56g（
NH4）2SO4，定容至1L。
6、考染脱色液：
冰乙酸50ml，甲醇165ml，水785ml
附录II?
考马斯亮蓝G-250法蛋白质标准曲线
管号
1
3
5
6
7
标准蛋白含量/ug
10
20
30
40
50
60
标准蛋白溶液/ul
H2O/ul
100
90
80
70
考马斯亮蓝G-250
5ml
A595nm
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