API含量测定验证方案1Word文档格式.docx

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姓名

部门

1、概述………………………………………………………………………………………………5

2、试验所需仪器……………………………………………………………………………………5

3、试剂和样品………………………………………………………………………………………5

4、色谱条件…………………………………………………………………………………………5

5、溶液配制…………………………………………………………………………………………5

6、专属性试验………………………………………………………………………………………6

7、溶液稳定性试验…………………………………………………………………………………6

8、线性试验…………………………………………………………………………………………7

9、回收试验…………………………………………………………………………………………7

10、精密度试验……………………………………………………………………………………8

11、检出限和定量限………………………………………………………………………………9

12、含量测定方法评价……………………………………………………………………………10

1、概述

通过对API含量测定方法的验证，得到可信赖的和准确的数据，用于药品的含量测定，从而验证该方法的可行性。

2、试验所需仪器

分析天平（灵敏度为0.01mg）型号编号有效期

液相色谱仪型号编号有效期

3、试剂和样品

乙腈HPLC级

API标准品USP标准品

API有关物质AUSP标准品

有关物质BUSP标准品

有关物质CUSP标准品

4、色谱条件

色谱柱：

4.6mm×

10cmC8柱，其填料粒径为3.5微米

检测波长：

254nm

流速：

1.0ml/min

进样量：

20μl

柱温：

40℃

流动相：

A溶液和B溶液不同比例的混合溶液。

（见下表）

其中，稀释液——水：

乙腈（60：

40）

A溶液——水：

乙腈（70：

30）

B溶液——水：

乙腈（50：

50）

时间（分钟）

A溶液

B溶液

洗脱方式

0-6.5

100→50

0→50

线性梯度

6.5-10

50→0

50→100

10-20

100

衡梯度

20-20.1

0→100

100→0

20.1-28

5、溶液配制

系统适应性溶液：

取API标准品和API相关物质A和相关物质B标准品，精密称定，用稀释液配制成0.05mg/ml的溶液。

标准溶液：

取适量API标准品，用乙腈溶解，超声处理，得到1.0mg/ml的溶液。

取4ml该溶液置于10ml容量瓶中，用水稀释至刻度。

用稀释液进一步稀释，即得浓度为0.04mg/ml的溶液。

供试溶液：

取本品约20mg，置于50ml容量瓶中，精密称定，用20ml乙腈溶解（可以超声处理），然后用水稀释至刻度。

吸取1ml此种溶液置于10ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀即得。

6、专属性试验

取系统适应性溶液注入色谱系统，记谱色谱图，API相关物质B（离API峰最近的杂质峰）与API峰的分离度应不小于1.5，各杂质峰分离良好，同时取稀释液作空白溶液，注入色谱系统，记谱色谱图，在API出峰处无干扰峰出现。

同时与API降解试验结果对比，各降解产物峰在API峰处无干扰，不影响API测定。

7、溶液稳定性试验

吸取1ml此种溶液置于10ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀即得制成供试品溶液。

取供试品溶液分别于0小时，2小时，4小时，6小时，8小时注入色谱系统，记谱色谱图，记录API峰面积，8小时内API峰面积的相对标准偏差（RSD%）不大于2.0%。

时间（h）

2

4

6

8

RSD（%）

API峰面积

8、线性试验

200%标准贮备溶液：

取API标准品20mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用20ml乙腈溶解（可以超声处理），然后用水稀释至刻度。

精密吸取10ml此种溶液置于50ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀即得浓度为0.08mg/ml的200%的标准贮备溶液。

160%标准溶液：

精密移取8.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。

120%标准溶液：

精密移取6.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。

100%标准溶液：

精密移取5.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。

80%标准溶液：

精密移取4.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。

40%标准溶液：

精密移取2.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。

20%标准溶液：

精密移取1.0ml的200%标准储备溶液置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混匀即得。

分别取上述线性供试品溶液注入液相色谱仪，记录API峰面积，以API的峰面积对其浓度进行一元线性回归，其相关系数（R）不小于0.999。

线性溶液

20%

40%

80%

100%

120%

160%

200%

浓度（mg/ml）

0.008

0.016

0.032

0.04

0.048

0.064

0.08

峰面积

线性方程

Y=ax+b

相关系数

r2=

r=

9、回收试验（标准加入法）

标准溶液：

按方法要求制备

供试品溶液：

120%加标供试品溶液：

以线性试验中120%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液，平行制备三份。

100%加标供试品溶液：

以线性试验中100%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液，平行制备三份。

80%加标供试品溶液：

以线性试验中80%的标准溶液替代稀释液配制供试品溶液，平行制备三份。

测试法：

分别吸取上述配制好的溶液，按前述色谱条件进样，记录API峰面积，按下式计算回收率，要求回收率在98%~102%范围内，9个回收率的RSD%应不大于2.0%。

供试品

样品号

1

平均值

100%标准溶液

3

5

80%加标供试品

回收率%

100%加标供试品

120%加标供试品

回收率的RSD%

10、精密度试验（系统精密度，重复性和方法中间精密度试验）

方法重复性-1：

第一天（不同人或不同仪器），按5中供试品配制方法，平行配制六份样品，按含量测试法进行测定，六份样品检测结果的相对标准偏差（RSD）不大于2.0%。

方法重复性-2：

第二天（不同人或不同仪器），按5中供试品配制方法，平行配制六份样品，按含量测试法进行测定，六份样品检测结果的相对标准偏差（RSD）不大于2.0%。

每次新鲜配制标准溶液和供试品溶液。

方法中间精密度：

两次方法重复性的12个结果的RSD%应不大于3.0%。

系统精密度：

两次方法重复性试验的标准溶液的6次重复进样峰面积的RSD%应不大于2.0%。

标准溶液重复进样结果

样品份数n

RSD%

系统精密度-1

系统精密度-2

含量%

方法重复性-1

方法重复性-2

中间精密度

11、检出限和定量限

对线性溶液中20%的标准溶液的S/N进行评价，定量限S/N应不小于10，检出限S/N应不小于3。

式中：

CDL——检出限（g/ml）

CQL——定量限（g/ml）

C——样品浓度（g/ml）

S/N——信噪比

信噪比

定量限保证浓度

检出限保证

12、含量测定方法评价

附：

我们的相关提问：

1、上面5中标准溶液的配制是直接从USP31中翻译过来的，但我们觉得那种说法很繁琐，并且标准溶液和样品溶液配制方法不一致，我们觉得直接按它的供试品溶液配制方法配制标准品挺好的，后面验证时我们也是就按供试品溶液配制法配的标准溶液。

不知是否妥当，请你们参考一下。

有关物质验证时也涉及到这个问题。

2、含量方法中间精密度12个数据的RSD%多少合适，相关物质呢？

我们以前做国内只做过6个数据的评价。

3、原料药的回收试验怎么做啊，请指点一下。

上面我们是按你们给我们残留溶剂的方案套用过来的。

我们以前做国内一般都不做原料药的回收试验，而是直接从精密度等其他验证项目中推论而得。

我们只做过制剂的向空白辅料里加原料的回收试验。

4、我们的含量和相关物质都是按USP31方法做的，是不是实际上只需做精密度，溶液稳定性，专属性，降解试验就可以了?

5、我们看了一下Q2A，含量测定时是不是不需做检出限和定量限？

6、在上面的含量方案里我们把所有验证内容都理出来了，还是请你们一一给我们审阅一下，把你们的建议给我们提出来。

非常的感谢！