凯氏定氮法实验报告Word下载.docx
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一、【实验目的】
1.掌握凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量的原理和方法
2.学会使用凯氏定氮仪
二、【实验原理】
凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。
使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以甘氨酸为例，其反应式如下：
NH2CH2COOH+3H2SO4=2C02+3SO2+4H2O+NH3
（1）
2NH3+H2SO4=（NH4）2SO4
（2）
（NH4）2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3（3）
反应
（1），
（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）凯氏蒸馏烧瓶中进行（图1）。
蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在14％~18％，平均为16％）。
凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋白质含量。
三、【试验器材】
1.卵清蛋白
2.凯氏定氮仪
3.电炉
4.消化架
5.锥形瓶100ml（×
5）
6.量筒10ml（×
1）
7.滴定管（5ml，可读至0.02ml）
8.凯氏烧瓶（×
2）
9.玻璃珠
10.吸耳球
11．移液管（2ml，5ml，10ml×
1）
四、【实验试剂】
1.卵清蛋白溶液：
2g卵清蛋白溶于0.9％NaCl溶液并稀释至100ml。
如有不溶物，离心取上清液备用。
2.浓硫酸（A.R.）
3.硫酸钾-硫酸铜混合物：
硫酸钾3份与硫酸铜1份混合研磨成粉末。
4.30%氢氧化钠溶液：
30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。
5.2%硼酸溶液：
2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至100ml。
6.混合指示剂：
0.1%甲基红乙醇溶液和0.1%甲烯蓝乙醇溶液按体积比4:
1混合。
7.0.00963mol/L标准盐酸溶液：
用恒沸盐酸准确稀释标定。
五、【实验操作】
1．样品的消化
将两个50mL的凯氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加1.0mL蒸馏水，作为空白。
另一只烧瓶内加入1.0mL样液（卵清蛋白液）。
然后用取样器各加浓硫酸4mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾－硫酸铜混合物约200mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到凯氏定氮烧瓶的底部。
烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，注意先启动抽风机在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。
待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。
消化时间为2～3h，冷却，准备蒸馏。
在消化时可以同时进行第二步。
2．定氮仪的洗涤
仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。
蒸气发生器中装加有H2SO4的蒸馏水和数粒沸石，加甲基橙指示剂后显粉红色。
加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受锥形瓶瓶。
每次使用前，需用蒸汽洗涤5分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。
将一只盛有5mL2％硼酸液和1~2滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏3分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。
若硼酸的颜色变为淡绿色，说明定氮仪内有残留氨，需要进一步用蒸汽洗涤。
若反应室内有上次操作剩余的残夜，
3．标准品练习（标准硫酸铵溶液，含氮量0.3mg/ml）
仪器洗好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。
取下棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml硫酸铵溶液，然后将玻璃塞放回，向玻璃杯中加入10ml30%NaOH溶液，旋转棒状玻璃塞，将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中，并留少量液体作水封。
等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时，继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。
并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶。
立即用标准盐酸溶液进行滴定，如果用滴定结果计算出的标准硫酸铵中氮含量接近于0.3mg/ml。
则说明整个实验操作正确，可以进行下一步。
4．样品测定
取下11棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml消化好的样品溶液，然后将玻璃塞放回，向7玻璃杯中加入10ml30%NaOH溶液，旋转棒状玻璃塞，将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中，并留少量液体作水封。
立即用标准盐酸溶液进行滴定，按上述方法洗涤仪器准备下一次蒸馏。
重复蒸馏并滴定三次。
将2ml消化好的样品溶液改为2ml消化后的空白对照溶液，其他操作同上，测量三组。
三组空白测量中，若锥形瓶中的硼酸溶液不变色，则无需滴定。
六、【注意事项】
1．凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。
其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。
2．普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。
3．定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。
蒸馏时需控制火力以避免样液倒吸。
4．消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。
可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。
5．消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。
若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
6．蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用。
若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀。
所以，加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。
7．蒸气发生瓶内的水装至2/3体积并且保持酸性（在蒸气发生瓶内的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸），以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。
8．因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力，而反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。
所以，蒸馏时，蒸气要均匀、充足，蒸馏中不得停火断气，否则，会发生倒吸。
停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸1min后关掉热源。
七、【实验结果】
1．结果
表一各组实验消耗的标准盐酸体积（ml）
1
2
3
平均
标准品练习
4.40
空白1
0.09
0.13
0.11
样品3
2.75
2.92
2.86
2.84
2．计算
m=
式中m：
样品中的含氮的质量，即100ml样品中含氮量（mg）
A：
滴定样品消耗的HCl溶液体积（ml）
B：
滴定空白消耗的HCl溶液体积（ml）
V：
相当于未稀释样品的体积（ml）
c：
盐酸物质的量浓度（mol/L）
14.008：
每摩尔氮原子质量（g/mol）
100：
100ml样品
所以可得：
1.标准硫酸铵中的N含量：
=0.297mg
该结果与标准值的相对误差=（0.297—0.3）/0.3×
100％=1％，这表示我们整个的实验操作正确。
2．蛋清中N含量（100ml样品）：
m=
=18.41mg
3．若样品中含氮物均为蛋白质，则蛋清样品中蛋白质的含量为：
18.41×
6.25=115.063mg
八、【结果分析及讨论】
1．分析：
1．在测量标准硫酸铵中含氮量时，我们测得的结果为0.297mg/ml，而标准值为0.3mg/ml,相对误差为1%，这说明我们组的实验仪器状态良好，而且操作也是正确规范的。
2．在测定样品中氮含量时，我们的测定结果为18.41mgN/ml,而且三组测量数据的相对偏差分别为2.55%，2.23%，0.76%，可见相互之间偏差很小，即实验准确性较高。
由此推出实验室提供样品含氮量也应该在18.41mgN/ml左右。
2．讨论：
本实验定氮的目的是确定样品中蛋白的含量，使用凯氏定氮法测定蛋白含量具有许多优点。
该方法可用于食品的蛋白质分析，操作相对比较简单，实验仪器和实验试剂相对比较便宜，并且结果准确，是一种测定蛋白质含量的经典方法。
但本方法最大的缺点在于最终测定的是总氮，而不仅仅是蛋白质氮，并且实验的时间太长，关于这一点在本次实验中深有体会。
除了凯氏定氮法，测量蛋白含量常用的方法还有双缩尿法、Folin－酚试剂法和紫外吸收法。
其中Folin－酚试剂法在先前的实验中已经做过，这种方法灵敏度高并且操作简便、快速，但准确度相对不高，且有的检测不可用。
每一种方法都有其优点与不足，方法的选择要由实际情况来定。
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