学位论文几种澄清剂在果酒澄清中的作用比较生物技术Word格式.docx
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0.前言
正常果酒的外观品质应澄清透明的。
即使有轻微的失光，也会被认为是质量不好乃至变质的表现，而且长期贮存后的果汁果酒容易发生混浊沉淀，并可发生氧化变质。
因此在生产制作果酒时，必须力求制成完全透明的果汁果酒。
造成浑浊的原因［1］有很多，主要是与天然存在的酚类物质有关。
当果汁果酒中的蛋白质和果胶物质与多酚类物质长时间共存时，就会产生浑浊的胶体，乃至发生沉淀［2］。
因此需要加入各种澄清剂以除去大部分上述易形成沉淀成分，使果汁果酒获得好的风味及保持长期的稳定性［3］。
果酒澄清剂有很多种，澄清方法也多种多样，包括物理、化学、生物等。
但目前澄清剂在果酒上的研究还未深入研究报道。
本实验以桔子汁发酵原酒为原料，选用不同澄清剂及组合进行澄清实验，得到较好的澄清组合，使酒体清亮透明、稳定性强。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂材料
安琪（angel）酵母、新鲜的澄汁1000ml、蒸馏水、葡萄糖、桔子酒、明胶、PVPP、丹宁、薄层层析硅胶。
1.1.2实验仪器
糖度计、离心机、722型分光光度计、培养箱、三角烧瓶、灭菌锅、烧杯、试管、量筒、移液管、电子天平、小滴管
1.2方法
1.2.1桔子果酒的制备
用榨汁机将准备好的新鲜桔子榨成汁，利用糖度计测试糖度，由于不做发酵工艺只做澄清度，因此无需加入葡萄糖调节糖度。
糖度测试完毕后分装到1000ml三角烧瓶后进行115℃灭菌30分钟，接入干酵母粉0.6g/1000ml恒温（28℃）发酵五天。
通过离心除去菌体，得到桔子酒原液。
1.2.2澄清剂的制备方法
明胶溶液［4］：
明胶在用之前，必须在水中溶解，因此称量1.00g明胶置于30ml热水中，搅拌至完全溶解。
待冷却到室温时，转移至50ml容量瓶中定容得到2%的明胶溶液，取10mL2%的上述溶液稀释得到0.4%的明胶溶液待用。
丹宁溶液：
称量1.00g丹宁溶于50ml蒸馏水中，加热到全部溶解，配成2%的溶液。
取5mL2%的上述溶液稀释得到0.08%的丹宁溶液待用。
聚乙稀吡咯烷酮（PVPP）溶液：
称量1.00gPVPP溶于50ml蒸馏水中，加热到全部溶解，配成2%的溶液待用。
薄层层析硅胶溶液：
称量1.00g薄层层析硅胶溶于50ml的蒸馏水中，加热到全部溶解,待冷却后转移至50mL的容量瓶中定容后，得到2%的薄层层析硅胶溶液待用。
1.3澄清方法
1.3.1单因素实验
①明胶对桔子酒原液的澄清作用
取洁净试管9个，依次编号1、2、3…9，分别装入桔子酒原液5ml，按试管的编号依次加入0.4%的明胶澄清剂0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml,静置。
观察果酒溶液颜色的变化和沉淀速度的快慢并记录，20分钟后对加有明胶澄清剂的果酒溶液进行离心（3000r/min）5分钟，去除沉淀，测定上清液的透光率。
丹宁对桔子酒原液的澄清作用
取洁净试管6个，依次编号1、2、3…6，分别装入桔子酒原液5ml，按试管的编号依次加入0.08%的丹宁溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml,静置。
观察果酒溶液颜色的变化和沉淀速度的快慢并记录，20分钟后对加有丹宁澄清剂的果酒溶液进行离心（3000r/min）5分钟，去除沉淀，测定上清液的透光率。
③PVPP对桔子酒原液的澄清作用
取洁净试管11个，依次编号1、2、3…10、11，分别装入桔子酒原液5ml，按试管的编号依次加入2%的Pvpp溶液0.2ml、0.4ml…1.2ml、1.3ml、1.4ml…1.7ml,静置。
观察果酒溶液颜色的变化和沉淀速度的快慢并记录，20分钟后对加有Pvpp澄清剂的果酒溶液进行离心（3000r/min）5分钟，去除沉淀，测定上清液的透光率。
④薄层层析硅胶对桔子原酒液的澄清作用
取洁净试管8个，依次编号1、2、3…8，分别装入桔子酒原液5ml，按试管的编号依次加入2%的硅胶溶液0.4ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml、2.0ml、2.3ml、2.5ml,静置。
观察果酒溶液颜色的变化和沉淀速度的快慢并记录，20分钟后对加有硅胶澄清剂的果酒溶液进行离心（3000r/min）5分钟，去除沉淀，测定上清液的透光率。
1.3.2组合因素实验
取洁净试管数组，各加入5ml桔子酒原液，按正交试验设计表，加不同容度澄清剂；
观察果酒溶液颜色的变化和沉淀速度的快慢并记录，离心去除沉淀，测定上清液的透光率。
1.3.3澄清效果的测定：
酒透明度的测定［5］，采用分光光度法，在623nm下测定酒的透光率T623，以蒸馏水做参比（T623=100%）。
酒澄清效果的测定，将桔子果酒盛放在试管中，并按一定的比例加入澄清剂，搅动，液面平静后静置。
然后，对混浊液进行离心，测定透光率。
1.4试验流程
桔子果酒原酒的制备＝＞离心原酒＝＞加入澄清剂＝＞离心＝＞澄清效果测定
2.结果与分析［6］［7］［8］
发酵后测得原酒残糖含量为1.0%，表明发酵基本完成。
离心后原酒以蒸馏水做空白在623nm的波长下测得透光率为42。
（澄清后透光率-原橙汁果酒液透光率）
澄清率（P）＝───────────────────*100%
原橙汁果酒液透光率
当P<
0时——表示未达到澄清效果
P越大澄清效果越好
2.1明胶的澄清效果
表1:
明胶的澄清试验结果
明胶（ml）
T（%）
颜色变化
P（%）
沉降速率
02.
50
棕黄色
19.05
/
0.4
51
21.43
0.6
51.5
22.62
0.8
1.0
55
30.95
产生少许絮状物
1.2
2.0
52
23.81
2.5
3.0
47
棕红色
11.90
明胶是动物胶原蛋白经部分水解衍生的分子量10000-70000的水溶性蛋白质（非均匀的多肽混合物）。
当制明胶时，可用酸性或碱性溶液处理原料，对饮料处理，一般用酸性明胶，在低pH值下酸性明胶溶液带有较高正电荷，在饮料中反应快且好，这是由于蛋白质的等电点（IEP）造成的。
酸性明胶溶液的等电点是8.5-9.0，碱性明胶溶液的等电点是4.5-5.0，饮料pH值与明胶等电点相差越大，明胶蛋白质所带正电荷越多［9］。
明胶带正电荷，可与丹宁、多缩戊糖等带负电荷的物质发生电中和凝结而沉淀使酒得以澄清。
明胶除具有良好的絮凝性外，还具有吸附能力，可使果酒色泽变浅。
明胶对酒的脱色程度小，酒体稳定，色泽好，主要用于去处单宁的澄清剂。
在日常生活中，使用率较高，多用于食品行业。
从表1可以看出，随明胶浓度的增加澄清度有上升的趋势，但明胶的量达到一定程度后澄清度出现下降。
从一些文献中可以得知：
在澄清葡萄酒中明胶用量为011～013g/L。
如果添加过量，优等明胶会损害饮料的风味和理想的琥珀色，质量差的明胶则引起悬浮剂的作用。
因此明胶的用量是一个重要的影响因素。
加入明胶后，形成的明胶—丹宁酸盐的络合物，该物质悬浮于橙汁果酒中，在短时间内离心效果不是很好，从应用的角度考虑，明胶单独使用对橙汁酒澄清无明显作用。
可以考虑与其它澄清剂结合使用。
2.2丹宁溶液的澄清效果
表2:
丹宁溶液的澄清试验结果
丹宁
0.1
61
45.24
产生絮状沉淀
0.2
62
47.62
0.3
60
42.86
0.5
57
35.71
溶液混浊
我们知道，单宁种类较多，其中最为普通的为焦性没食子酸单宁，由五倍子制得。
不同来源的单宁虽结构不同，但具有一些共同的性质：
都是无定型粉末，易溶于水、酒精及丙酮，其水溶液呈酸性并有涩味，与蛋白质生成不溶水的沉淀，在氧化酶的作用下，发生氧化聚合而生成黑褐色物质。
丹宁的澄清机理是：
通过与桔子果酒中某些涩味丹宁和杂色物质结合形成絮状的特殊方式而起到澄清的作用或者利用蛋白遇到丹宁的凝聚性质和吸附能力而起到澄清果酒的作用。
从表2中可以看出，随丹宁浓度的增加，澄清度呈下降，主要原因是丹宁溶液本身是褐色的，颜色的影响大于该浓度丹宁的澄清效果。
不过从个试验中可以明显看到絮状沉淀产生，由此可知丹宁对橙汁酒的澄清还是有一定的作用，但是在使用时，受到浓度的限制，浓度越高其澄清效果越差。
所以在日常生活中我们也可以考虑降低浓度使用，或与其它澄清剂结合使用。
2.3PVPP的澄清效果
表3:
PVPP的澄清试验结果
pvpp
黄色
53
26.19
54
28.57
56
33.33
1.3
59
40.47
1.4
1.5
1.6
58
38.09
1.7
聚乙烯聚吡咯烷酮（pvpp）是纯的乙烯基吡咯烷酮的交联均聚物，是具有吸湿性的易流动的白色粉末，有微臭，不溶于水和乙醇、乙醚等所有常用的溶剂。
pvpp的分子结构中具有与其聚合度相同数目的酰胺键，主要吸附酒中分子量500-1000的丹宁，而这类丹宁是引起发酵酒不稳定的主要因素之一，且在一定程度上占主导地位。
通过pvpp对丹宁的吸附，可大大减缓酒中蛋白质与丹宁的结合速度，使发酵酒稳定性提高。
由表3可知，随pvpp浓度的增加，澄清度呈上升趋势，色度微呈下降趋势，无明显的絮状沉淀。
说明pvpp对提高桔子果酒的稳定性，改善色泽有一定的作用。
2.4薄层层析硅胶的澄清效果
表4：
薄层层析硅胶溶液的澄清试验结果
薄层层析硅胶
慢
63
50.00
65
54.76
66
57.14
1.8
68
61.90
64
52.38
2.3
薄层层析硅胶广泛用于各种天然、合成物质的分析和分离。
目前已大量用于医药、农药、中草药、有机化工产品、石油化工产品以及粮食、食品等的主要成分或微量杂质的定性与定量分析和某些物质的提取。
本次试验主要是想检测薄层层析硅胶在果酒中的应用，其澄清效果的优劣。
从上表中可以知道，在澄清过程中其沉降速率较慢，须加长静置时间。
2.5明胶--丹宁组合澄清效果探究［10］
表5：
明胶--丹宁组合澄清试验结果
试管号
明胶（A）0.4%
丹宁（B）0.08%
1
2
3
4
0.7
5
6
58.5
39.29
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
K1
224
238
B>
A
A9B9
K2
229
232
K3
235
K4
221
△K
17
将明胶与丹宁按表格中配方，各取不同的量加入到5ml橙汁原酒液中，观察其现象，发现当两种溶液同时加入时都迅速产生浑浊，加强离心后透过率有所增加，但效果不是很好。
离心后颜色呈棕红色。
由表6数据分析表明：
同时加有明胶和丹宁的橙汁原酒液会出现二次混浊，但通过静置，离心后透光率有所提高。
比较两个因素的极差ΔK，极差大小主次顺序为B＞A，即丹宁是主要影响因素。
因此在实验过程中对于丹宁的用量要非常小心。
由于单宁的酚羟基通过氢健与蛋白质的酰胺基连接后，能使明胶单宁形成复合物而聚集沉淀，同时捕集和清除其他悬浮固体，另外明胶可吸附果酒中的单宁色素，而且能减少果汁的粗糙感。
所以明胶与单宁常结合使用，不仅可用于果汁、果酒的澄清，还可用于果汁的脱色，因此明胶—丹宁法可作为一种经典的果酒澄清方法。
2.6明胶—PVPP组合澄清效果探究
表6：
明胶—PVPP组合澄清试验结果
试验观察可以发现，两种溶液同时加入时无明显变化，离心后透过率有所增加。
从表6分析可以看出，在低浓度明胶-PVPP组合下，对橙汁果酒澄清方面有所改善。
A1B1的溶度组合在实验和理论中都得到较好效果。
而高浓度组合效果不佳。
明胶是主要的影响因素（A>
B）。
2.7明胶—薄层层析硅胶组合澄清效果探究
表7：
明胶—薄层层析硅胶组合澄清试验结果
硅胶（B）2%
0.9
42.24
182
184
A>
B
A4B4
A5B5
188
181
185
180
表7各组实验数据，经正交统计分析，比较两个因素的极差ΔK，极差大小的主次顺序为A＞B，即主要的影响因素是A（明胶）。
由上表可以看出，浓度较低时透光率较高，与两者作为单因素使用时比较，与明胶结合使用时，澄清效果有所提高。
但是在日常生活中，明胶与薄层层析硅胶结合作为澄清剂使用的机会比较少。
3.结论与探讨
3.1通过本试验，可以基本了解果酒的生产工艺过程，一般的步骤是：
新鲜桔子＝＞榨汁＝＞离心＝＞接种＝＞发酵＝＞陈酿＝＞调配＝＞澄清（过滤）＝＞包装。
澄清剂的种类很多[11]，本次试验是通过采用明胶、PVPP、丹宁等澄清剂对橙汁果酒进行了澄清，并从透光率角度评价澄清效果。
3.2影响澄清的因素很多，如：
温度、粘度、pH值、处理步骤、计量、容器、搅拌器、混合时间等。
除此以外，不同的果酒所含的悬浮颗粒不同，具有各自特性。
因此不同果酒选用不同的澄清剂，对于橙汁果酒的澄清，综合所有实验数据进行分析，明胶与其它澄清剂结合使用，其澄清率大大提高，但此结论是否有普遍意义或能否在生产上使用有待进一步探讨。
3.3从组合性实验中，我们可以看到明胶和丹宁组合后，它的效果有所提高，但并不显著，可能是由于明胶与丹宁在橙汁果酒溶液中发生复杂的生化反应（可能是些酸性物质），这样不仅破坏了原明胶电荷性、絮凝性、以及吸附能力，而且发生二次混浊产生大量沉淀和难溶的悬浮物。
因此，单宁含量的不同，决定了明胶的剂量，单宁含量少的白葡萄酒下胶前要预先加入一定量的单宁，没有单宁，只加明胶是不可能澄清的。
另一方面，明胶与PVPP的组合使用，澄清效果有所改观，但效果并不显著，不适用于生产。
3.4果汁果酒的稳定性是一个复杂的问题，澄清剂的作用就是澄清与去除果汁果酒中引起混浊及颜色和风味改变的物质。
以上简要介绍了明胶、单宁、薄层层析硅胶、PVPP的制备、性质、功效。
这些澄清剂各有优缺点，明胶-单宁法是一种经典的方法，当明胶与带负电荷的单宁相聚合并将果汁中其他悬浮物吸附一起下沉，从而达到澄洽效果，但使用过量容易引起二次混浊；
PVPP是一种人工高聚物，效果好但价格高。
因此，在实际生产中，要选择合适的澄清剂与澄清工艺，可以几种澄清剂结合使用。
但只有操作简单，周期短，费用低，才能在实际生产中广泛应用。
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致谢
（Acknowledgement）
本论文是在指导老师张宝的悉心指导下进行和完成的，从论文开始准备到试验设计、操作、记录到论文的写作、修改和最后定稿，都凝聚着他的心血。
至此论文结稿之际，谨向恩师致以最为崇高的敬意并感激他对学生人生道路上的指点、学术上的谆谆教诲以及生活上的无私帮助。
张宝老师对学术的严谨态度让我终身难忘，将永远激励和鞭策我不断勤奋努力。
本论文的实验工作是在江西农业大学生物工程系实验室完成的，在此过程中得到了系里领导及各位老师的关心和帮助，在这里我对他们表示深深感谢。
珍贵的大学生活已经接近尾声了，回顾过去在校期间得到了江西农业大学生物工程系的各位领导和老师对我的关心和帮助，籍此我要衷心的感谢他们。
我要说的是，衷心感谢敬爱的父母和我的朋友们在我的漫长的求学过程中对我无微不至的关心和无怨无悔的支持。
我不会忘记你们的谆谆教导，在今后生路上，我会更谦虚，不断自我反思，完善自我，为未来的发展打下坚实的基础。
最后，感谢母校的培育之恩！
作者：
刘美贞
2007年4月
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