PCR技术总结Word格式.docx

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③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度（2.0Kb）。

由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶（TaqDNAPolymerase）。

此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术的基本原理

　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　PCR的反应动力学　PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。

Y代表DN***段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列DN***段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

　　PCR扩增产物　可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'

端之间，是需要扩增的特定片段。

短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'

端开始延伸，其5'

端是固定的，3'

端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。

进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。

引物在与新链结合时，由于新链模板的5'

端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'

端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DN***段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

　　10×

扩增缓冲液　10ul

　　　4种dNTP混合物　各200umol/L

　　　引物　　　　　各10～100pmol　

　　　模板DNA　　　　0.1～2ug　

　　TaqDNA聚合酶　2.5u　

　　　Mg2+　　　　　　1.5mmol/L

　　　加双或三蒸水至　100ul

　　PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

　　引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

　　①引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

　　②引物扩增跨度：

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

　　③引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'

端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

　　⑤引物3'

端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

　　⑦引物的特异性：

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

　　引物量：

每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

　　酶及其浓度　目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量2。

5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。

HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。

多次冻融会使dNTP降解。

在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

　　模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；

蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。

提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。

RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。

　　①变性温度与时间：

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　②退火（复性）温度与时间：

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）

　　　　　复性温度=Tm值-（5～10℃）

　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

　　③延伸温度与时间：

TaqDNA聚合酶的生物学活性：

　　　　70～80℃150核苷酸/S/酶分子

　　　　70℃60核苷酸/S/酶分子

　　　　55℃24核苷酸/S/酶分子

　　　　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DN***段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；

扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。

PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点

特异性强：

　　　PCR反应的特异性决定因素为：

　　　①引物与模板DNA特异正确的结合；

　　　②碱基配对原则；

　　　③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；

　　　④靶基因的特异性与保守性。

　　其中引物与模板的正确结合是关键。

引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。

聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。

再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高：

　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=-6）水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；

在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；

在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速：

　　PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低：

　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

PCR扩增产物的分析

　　PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。

PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

　　凝胶电泳分析：

PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。

PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。

　　琼脂糖凝胶电泳：

通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳：

6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

　　酶切分析：

根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

　　分子杂交：

分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。

　　Southern印迹杂交：

在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。

此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

　　斑点杂交：

将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

核酸序列分析：

是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

PCR技术

（二）：

PCR反应模板的制备

PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基本技能，决定分离模板核酸（DNA或RNA）的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的关键是除去杂质（蛋白质、酶、脂肪等）.除去抑制TaqDNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的产量.

　　传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:

氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化处理标本，视PCR实验的目的（是科研还是检测）及环境条件而定.

模板核酸的提取制备方法

（一）蛋白酶K消化裂解法：

适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞（包括石蜡包埋组织）绒毛、毛发、精斑、血液（血清、血浆、全血）局部分泌物、尿，粪便等.

　　1.试剂配制

　　①蛋白酶K消化液:

10mmol/LTris.cl（PH8.0）

　　10mmol/LEDTA

　　150mmol/LNaCL

　　0.5%SDS

　　100～200ug/ml蛋白酶K.

　　②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.

　　2.提取方法:

　　有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.

　　临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时，或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:

异戊醇（49:

1）抽提一次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇（或加等体积的异丙醇）-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul用于PCR扩增，或放-20℃保存.

　　蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增.如杂质较多，还可经酚:

氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.

（二）直接裂解法:

标本（组织细胞，分泌物）加PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化裂解液20～50ul（0.5%NP-40和0.5%吐温-20），95～98℃，15～30min以裂解病原体，裂解细胞.然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于PCR扩增.血清标本可直加等体积的消化液，加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解液，95℃30min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBVDNA.

　　（三）碱变性法:

取血清20ul，加入1mol/LNaOH20ul，37℃30min，离心，加1mol/LHCl20ul，离心后，取上清5ul，用于PCR扩增.*亦有用10ul血清加NaOH至0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR，其特异性和敏感性较前法更好.

　　（四）煮沸法:

经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或PBS，混匀后，100℃煮沸10～15min，14000r/min10min，取上清做PCR.

　　（五）碘化钠法:

取组织细胞及抗凝血液10～100ul，加等体积的6MNaI，反复轻混20s，加等体积氯仿:

1）振匀后，离心取上清加0.6体积的异丙醇，混匀后置室温3min.14000r/min10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有用100ul血清加裂解液300ul（6MNaI，0.5%十二烷基肌酸钠，10ug糖原，26mmol/LpH8.0Tris-HCL，13mmol/LEDTA）混匀后，60℃15min，加等体积异丙醇，离心沉定后，加TE液用于PCR扩增，其产量和质量较高.

　　（六）异硫氰酸胍法

　　此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.

　　1.异硫氰酸胍消化液

　　异硫氰酸胍4mol/L

　　柠檬酸钠（PH7.0）25mmol/L

　　十二烷基肌酸钠0.5%

　　β-巯基乙醇0.1mol/L

　　2.消化方法:

用50～100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀后，或65℃1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/LpH5.2的醋酸钠缓冲液，再加等体积的酚:

氯仿，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等体积异丙醇-20℃放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1～2次，真空干燥，沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增，或放-20℃保存.其它消化处理标本提模板核酸的方法有①异硫氰酸胍一二氧化硅法②异硫氰酸胍。

-玻璃粉法.③Chelex-100法.④全血直接扩增法⑤尿素消化裂解法.各有千秋，可根据。

情况选用。

PCR技术（三）：

TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是从一种水生栖热菌（Thermusaquaticus）yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的.

（一）酶活性与热稳定性

　　该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高（90℃以上）或过低（22℃）都可影响TaqDNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性.TaqDNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.TaqDNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高.

（二）离子依赖性

　　aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性.

（三）忠实性

　　TaqDNA聚合酶具有5'

→3'

聚合酶活性和5'

外切酶活性，而无3'

→5'

外切活性，它不具有Klenow酶的3'

校对活性.因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的.TaqDNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×

10-4.

（四）抑制剂

　　低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSD