PCR技术总结Word格式.docx

1、大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度（2.0Kb）。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶（Taq DNA Polymerase）。此酶的发现使PCR广泛的被应用。PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与

2、引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y（1X）n计算。Y代表DN*段扩增后的拷

3、贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DN*段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一

4、个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸， 其5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DN*段供分析与检测用。PCR反

5、应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为

6、20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其

7、它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M N

8、aOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（ 等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的

9、核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现

10、非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。变性温度与时间：变性温度低，解链

11、不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通

12、过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）复性温度=Tm值-（510）在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1K

13、b以内的DN*段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR反应特点 特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反

14、应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10- 12）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-

15、延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。PCR扩增产物的分析PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，

16、应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳： 通常应用12%的琼脂糖凝胶， 供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以

17、提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。PCR技术（二）：PCR反应模板的制备 PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸（DNA或RNA）的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质（蛋白质、酶、脂肪等）.除去抑制Taq DNA聚

18、合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量. 传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜， 使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化 处理标本，视PCR实验的目的（是科研还是检测）及环境条件而定. 模板核酸的提取制备方法 （一）蛋白酶K消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞（包括石蜡包埋组织）绒毛、毛发、精斑、血液（血清、血浆、全血）局部分泌 物

19、、尿，粪便等. 1.试剂配制 蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl（PH8.0） 10mmol/LEDTA 150mmol/LNaCL 0.5%SDS 100200ug/ml蛋白酶K. 蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中. 2.提取方法:有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等. 临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50100ul.混匀，5513小时， 或37过夜.加等体积的饱和酚抽提12次，再加等体积的氯仿:异戊醇（49:1）抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23m

20、mol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇（或加等体积的异丙醇）-20放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤12次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取38ul 用于PCR扩增，或放-20保存. 蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经9597或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底

21、，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高. （二）直接裂解法:标本（组织细胞，分泌物）加PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化 裂解液2050ul（0.5%NP-40和0.5%吐温-20），9598，1530min以裂解病原体， 裂解细胞.然后12000r/min离心510min，取上清2030ul用于PCR扩增.血清标本可 直加等体积的消化液，加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，9530min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBV DNA. （三）碱变性法:取血清20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，3730

22、min，离心，加 1mol/L HCl 20ul，离心后，取上清5ul，用于PCR扩增.*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，371h，再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR，其特异性和敏感性较前法 更好. （四）煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或PBS，混匀 后，100煮沸1015min，14000r/min 10min，取上清做PCR. （五）碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10100ul，加等体积的6MNaI，反复轻混 20s，加等体积氯仿:1）振匀后，离心取上清加0.6体积的异丙醇，混匀后 置室温3min.14000r/min 10mi

23、n，沉淀加10100ul，TE溶解，取510ul做PCR，亦有 用100ul血清加裂解液300ul（6M NaI，0.5%十二烷基肌酸钠，10ug糖原，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA）混匀后，6015min，加等体积异丙醇，离心沉定 后，加TE液用于PCR扩增，其产量和质量较高. （六）异硫氰酸胍法 此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等. 1.异硫氰酸胍消化液 异硫氰酸胍4mol/L 柠檬酸钠（PH7.0）25mmol/L 十二烷基肌酸钠0.5% -巯基乙醇0.1mol/L 2.消化方法:用50100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍

24、消化液振混匀 后，或651小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/L pH5.2的醋酸钠缓 冲液，再加等体积的酚:氯仿，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等 体积异丙醇-20放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1 2次，真空干燥，沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增，或放-20保存.其它消化处理标本提模板核酸的方法有异硫氰酸胍一二氧化硅法异硫氰酸胍。-玻璃粉法.Chelex-100法.全血直接扩增法尿素消化裂解法.各有千秋，可根据。情况选用。PCR技术（三）：Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是从

25、一种水生栖热菌（Thermusaquaticus）yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在7075生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的. （一）酶活性与热稳定性 该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒.温度过高（90以上） 或过低（22）都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5、

26、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可 保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为6568，有Mn2+存在时，其逆转录活性 更高. （二）离子依赖性 aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP

27、的浓度为0.70.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制4050%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.51.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性. （三）忠实性 TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和5外切酶活性，而无35外切活 性，它不具有Klenow酶的3校对活性.因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错 配，该酶是没有校正功能的.Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4. （四）抑制剂 低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSD