水稻黄绿叶基因YGL4的遗传分析和分子定位概要文档格式.docx
《水稻黄绿叶基因YGL4的遗传分析和分子定位概要文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《水稻黄绿叶基因YGL4的遗传分析和分子定位概要文档格式.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
西南大学水稻研究所/农业部西南作物遗传改良与育种重点开放实验室,重庆400716
摘要:
通过EMS诱变恢复系缙恢10号,获得了一个稳定遗传的全生育期黄绿化叶色突变体。
其叶绿素总含量稳定在2.01~2.28mgg−1之间,仅有对照的38.2%~50.5%。
与对照相比,黄绿叶突变体的有效穗和株高显著下降,而主穗长、一次枝梗数、主穗实粒数、结实率、千粒重则无明显差异。
遗传分析表明该性状受1对隐性核基因控制,命名为YGL4。
利用微卫星标记将YGL4定位于第10染色体微卫星标记RM3123和RM590之间,分别距其7.6cM和7.8cM。
在两标记间进一步设计SSR引物,将该黄绿叶基因定位于RM1162和RM7093之间,分别距其1.8cM和4.0cM。
为该YGL4基因的分子标记辅助选择育种和图位克隆奠定了基础。
关键词:
水稻（OryzasativaL.;
黄绿叶;
遗传分析;
分子定位
GeneticAnalysisandMolecularMappingofaYellowGreenLeafGene（YGL4inRice（OryzasativaL.
LIUMeng-Meng,SANGXian-Chun,LINGYing-Hua,DUPeng,ZHAOFang-Ming,YANGZheng-Lin,andHEGuang-Hua∗
RiceResearchInstituteofSouthwestUniversity/KeyLaboratoryofSouthwestCropGeneticImprovementandBreeding,MinistryofAgriculture,Chongqing400716,China
Abstract:
AleafcolormutantwasobtainedbyEMStreatingseedsofrestorerlineJinhui10,thismutationshowedcompleteyel-lowgreenleavesduringthelife,andcouldberegeneratedandinheritedstablyaccordingtotheobservationof5generations.Thecontentofitstotalchlorophyllrangedfrom2.01to2.28mgg−1,whichwasonly38.2%to50.5%oftheoriginalparent.Comparedwiththeoriginalparent,themutationhadnosignificantdifferenceinthetraitsofmainpaniclelength,firstbranchnumber,filledgrainnumberofmainpanicle,seedsettingrateand1000-grainweight,excepttheeffectivepanicleandplantheightwhichweredecreasedsignificantly.GeneticanalysisofF2populationsconfirmedthatthemutationalcharacterwascontrolledbyasinglerecessivenucleargene,temporarilydesignatedasYGL4.ThegenewasmappedbetweentwomicrosatellitemarkersRM3123andRM590,withgeneticdistancesof7.6and7.8cMtothetwomarkersrespectively.Newmicrosatellitemarkersweredesignedbe-tweenRM3123andRM590,andtheYGL4genewasfinalmappedbetweenRM1162andRM7093,withgeneticdistancesof1.8and4.0cMtoeachofthemrespectively.Thisresultprovidedafoundationofmolecularmarker-assistedbreedingandmap-basedcloningofYGL4gene.
Keywords:
Rice（OryzasativaL.;
Yellowgreenleaf;
Geneticanalysis;
Molecularmapping
水稻（OryzasativaL.是世界上最重要的粮食作物之一,是全球超过50%人口的主要食物和热量来源。
叶片是植物进行光合作用的主要器官,水稻产量的95%来自于叶片的光合作用,叶绿体除了光合作用外,还参与了氨基酸、脂肪酸、植物生长物质、
核苷酸、维生素以及次生代谢产物的合成[1]。
因此,叶片器官的突变对水稻的光合作用乃至生长发育都会产生重要的影响。
近年来,叶色突变体的利用价值越来越受到关注,现已成为研究植物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控
1406作物学报第35卷
制机理的特殊材料[2-5],同时叶色突变体在高光效育种和标记性状的利用上也具有重要的应用价值[6-8]。
据不完全统计,目前报道的水稻叶色突变的相关基因已经超过80个,这些突变体大致可分为白化型、黄化型、条纹型、转绿型、斑马叶等5大类。
其中黄化叶色突变体出现最多,且大多数受隐性核基因控制[9-10],已对部分基因进行了染色体定位[11-13],除了第12染色体外,其余11条染色体上均有分布。
在被定位的基因中至少6个叶色基因已被克隆[14-16]。
我们在EMS诱变籼稻恢复系缙恢10号后代中发现一个稳定遗传的黄绿叶突变体ygl4（yellowgreenleaf4,对其形态、叶绿素动态含量、主要农艺性状、遗传特性等进行了分析,并利用微卫星标记对该基因进行了定位,以期为突变基因的克隆及叶绿素缺失机理研究奠定基础。
1材料与方法
1.1供试材料
缙恢10号是西南大学水稻研究所选育的优良三系杂交水稻恢复系,已培育出多个品种通过国家或省审定。
利用EMS诱变缙恢10号种子,获得了一个黄绿叶突变体,经过连续自交5代,遗传性状稳定。
1.2叶绿素含量的测定
在苗期、抽穗期和成熟期测定突变体和对照缙恢10号的叶绿素含量。
突变体和对照各取5株独立测定,测定部位为倒二叶,时间为上午8:
30~9:
00,测定方法参照Lichtenthaler[17]。
1.3农艺性状的考查与分析
成熟期从小区中随机选取5株,考查株高、有效穗、穗长、一次枝梗数、主穗实粒数、千粒重、结实率等农艺性状,利用MicrosoftExcel软件进行统计分析。
1.4遗传分析
2007年夏在西南大学水稻研究所配制西农1A×
ygl4杂交组合,2007年秋于海南播种F1,获得F2代种子。
2008年夏在西南大学水稻研究所播种F2代,对每株进行叶色表型调查。
1.5DNA提取
于苗期选取幼嫩的叶片按CTAB法提取亲本和基因池DNA[18]。
群体DNA按碱煮法提取[19]。
1.6SSR分析
参照http:
//www.gramene.org/microsat/,由上海生工生物工程有限公司合成SSR引物。
PCR反应总体系为25μL,含2.5μL10×
PCRbuffer、1.3μL25mmolL−1MgC12、1.0μL2.5mmolL−1dNTPs、16.0μL的ddH2O、2.0μL10μmolL−1引物、2.0μL模板DNA、0.2μL5UμL−1TaqDNA聚合酶。
PCR反应程序为94℃预变性5min;
94℃变性30s,55℃退火30s,72℃复性1min,35个循环;
72℃延伸10min。
PCR产物经10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,快速银染后观察[20]。
1.7遗传图谱的构建
选取西农1A×
ygl4群体的F2为作图群体。
将具有ygl4带型的单株记为B,具有西农1A带型的单株记为A,具有F1带型的单株记为H,用Mapmaker3.0进行数据分析和作图。
用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离。
2结果与分析
2.1ygl4的表型和主要农艺性状
ygl4全生育期所有叶片均表现为黄绿色（图1,该性状能稳定遗传。
突变体的有效穗和株高与对照相比分别下降30.0%和8.9%,其他农艺性状与对照相比均没有显著变化（表1。
图1黄绿叶突变体分蘖期的表型
Fig.1Phenotypeofyellowgreenleafmutantandoriginal
parent（WTattilleringstage
2.2ygl4的叶绿素含量
ygl4的叶绿素含量比对照下降38.2%~50.5%,其中叶绿素a和叶绿素b的含量均有较大幅度的下
第8期刘梦梦等:
水稻黄绿叶基因YGL4的遗传分析和分子定位1407
表1黄绿叶突变体的农艺性状
Table1Agronomiccharactersofyellowgreenleafmutantanditsoriginalparent（WT
材料Material
有效穗
Effective
panicle
株高
Plantheight
（cm
主穗长
Mainpanicle
length（cm
主穗实粒数
Filledgrainnumberof
mainpanicle
一次枝梗数
Firstbranchnumber
千粒重
1000-grain
weight（g
结实率
Seedsettingrate
（%
ygl413.9B91.7B20.8A168A10.9A22.2A71.9AWT19.3A100.7A20.5A171A10.1A21.9A69.5A同一列中标以相同字母的数字在P=0.01水平上差异不显著。
ValuesfollowedbythesamecapitalletterforacharacterarenotsignificantlydifferentatP=0.01.
表2不同生育时期ygl4与野生型倒二叶的叶绿素含量
Table2Chlorophyllcontentoftheuppersecondleafofygl4andoriginalparent（WTatdifferentdevelopmentalstages（mgg−1
苗期Seedlingstage分蘖期Tilleringstage抽穗期Headingstage光合色素
Photosyntheticpigmentsygl4WTygl4WTygl4WT
总叶绿素Totalchlorophyll2.27B3.67A2.01B4.06A2.28B4.28A
叶绿素aChlorophylla2.06B2.50A1.79B2.81A2.16B2.93A
叶绿素bChlorophyllb0.21B1.17A0.23B1.25A0.16B1.35A
叶绿素a/bChlorophylla/b9.76A2.14B7.91A2.25B13.82A2.17B同一列中标以相同字母的数字在P=0.01水平上差异不显著。
降,说明ygl4黄绿叶性状是由总叶绿素含量的大幅度下降引起的。
同时,叶绿素a与叶绿素b的比值由野生型的2.14~2.25变化为突变体的7.91~13.82,表明叶绿素b的下降幅度大于叶绿素a。
从突变表型和叶绿素含量之间的关系来看,叶绿素含量越低,叶色越浅,二者存在明显的相关性,这与目前报道的大多数叶色突变性状类似[21]。
2.3YGL4的遗传分析
杂交组合西农1A×
ygl4的F1代植株叶片均表现为绿叶,表明该突变体受隐性基因控制,F2代单株间叶色出现分离,表现叶色正常绿色和黄绿叶两种情况,在4305株总群体中,正常株3245株、黄绿叶1060株,经χ2测验,绿苗与黄绿苗符合3∶1的分离比例（χ2=0.31<
χ20.05=3.84,表明该基因受1对隐性核基因控制。
2.4YGL4的分子图谱定位
选用西农1A×
ygl4的F2作为定位群体,共获得了1060个突变单株,用于基因定位。
在F2代中分别选取10株正常株和10株黄绿叶突变株构建正常基因池和突变基因池。
选用400对均匀分布于12条染色体上的微卫星标记对亲本西农1A和ygl4进行多态性分析,具有多态性的标记100对,多态性频率25%,进一步利用在两亲本间表现出多态性的引物扩增正常基因池和突变基因池,并用在基因池间检测到的多态性引物进行F2单株验证,结果发现位于水稻第10染色体的标记RM3123和RM590与黄绿叶突变基因表现连锁（图2,其中RM3123有161个单交换株,RM590有165个单交换株。
在两标记间进一步设计15对引物,结果发现RM1162和RM7093存在多态性,继续对隐性群体进行分析,发现RM1162有38个单交换株,RM7093有85个单交换株,最终将该黄绿叶基因定位于RM1162和RM7093之间,分别相距1.8cM和4.0cM（图3。
图2SSR标记RM590与突变位点连锁验证Fig.2LinkageanalysisbetweenSSRmarkerRM590and
mutantlocus
1:
西农1A;
2:
ygl4;
3:
正常池;
4:
突变池;
5~12:
F2群体中正常植株;
13~21:
F2群体中突变植株;
17:
单交换株。
Xinong1A;
ylg4;
normalgenepool;
mutantgenepool;
5–12:
singlenormalplantsinF2population;
13–21:
singlemutantplantsinF2population;
singlecrossing-overplant.
3讨论
叶绿体作为光合作用的场所,其发育调控机理的研究一直是植物生理和分子生物学研究的热点。
近年来,随着单子叶模式植物水稻的基因组测序完成,水稻功能基因研究愈来愈引起人们的关注。
目前世界上至少有12个研究机构分别建立了自己的
1408作物学报第35卷
图3YGL4基因在第10染色体上的分子定位Fig.3MolecularmappingofYGL4onchromosome10
突变体库[22]。
在突变体库中叶绿素合成缺陷的突变占的比例很高,这与叶色突变的分子机制复杂,突变基因可直接或间接干扰叶绿素的合成及稳定,经由多种途径引起叶色变化有关[23]。
水稻叶色变异性状的遗传,多数是核基因隐性突变引起,对细胞质突变引起的叶色突变体报道很少[16,24-25]。
本文报道的黄绿叶基因亦是由1对隐性核基因控制。
在第10染色体上定位的黄绿叶基因有fgl[26]和pgl[27],fgl位于第10染色体短臂,本文定位的YGL4位于第10染色体长臂上,虽然pgl与YGL4都位于第10染色体长臂上,但pgl基因是利用初级三体定位,而YGL4是利用分子标记定位所得,因此难以证明YGL4与pgl基因是否等位。
尽管很多叶色突变基因都得到定位,但仅有少数的基因被克隆。
且主要集中在编码叶绿素合成与降解途径中酶的基因。
Jung等[14]利用T-DNA插入突变体克隆了编码镁离子螯合酶大亚基的OsCHLH基因,Zhang等[28]通过图位克隆方法克隆了两个镁离子螯合酶亚基基因OsCHLD和OsCHLI,Wu等[16]图位克隆了一个控制水稻黄绿叶突变性状的基因YGL1,该基因在592位由C→T的错义突变导致其所编码酶的活性区在198位由Pro突变为Ser,从而降低突变体苗期叶绿素的生物合成,并延缓了叶绿体的发育。
Lee等[15]则在水稻中发现了两个与叶绿素a氧化酶高度同源的基因OsCAO1和OsCAO2,尽管它们序列相似,但有着完全不同的表达模式。
Morita等[29]利用γ射线诱变获得了5个OsCAO突变体并对它们进行了分析。
本研究将YGL4基因定位在水稻10号染色体SSR标记RM1162和RM7093之间,分别距其1.8cM和4.0cM,根据日本晴序列可知物理距离为402kb,利用gramene网站（http:
//www.gramene.org/对该区域序列进行分析,其间存在3个与叶绿素缺失相关的基因,其中2个编码叶绿素酸酯氧化酶（CAO,是催化叶绿素b生物合成的关键酶,这个酶的缺失或活性降低将影响叶绿素b的合成。
另外1个基因是CHL-CPN10,是一个存在于叶绿体中的伴侣蛋白,与叶绿体发育有关[30]。
但要最终确定哪个基因是YGL4,该基因是否是OsCAO1和OsCAO2的等位突变,或者是其他的尚未发现的基因,还有待进一步定位及对相关候选基因的互补验证,相关研究正在进行之中。
4结论
ygl4总叶绿素含量稳定在2.01~2.28mgg−1之间,仅有对照的38.2%~50.5%;
黄绿叶性状受1对隐性核基因控制;
将该黄绿叶基因定位于RM1162和RM7093之间,分别距其1.8cM和4.0cM。
References
[1]LeisterD.Chloroplastresearchinthegenomicage.TrendsGenet,
2003,19:
47−56
[2]MochizukiN,BrusslanJA,LarkinR,NagataniA,ChoryJ.
Arabidopsisgenomesuncoupled5（GUN5mutantrevealstheinvolvementofmg-chelataseHsubunitinplastid-to-nucleussig-
naltransduction.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98:
2053−2058[3]RobertML,JoseMA,JosephRE.GUN4,aregulatorofchlo-
rophyllsynthesisandintracellularsignaling.Science,2003,299:
902−906
[4]SternDB,HansonMR,BarkanA.Geneticsandgenomicsof
chloroplastbiogenesis:
Maizeasamodelsystem.TrendsPlantSci,2004,9:
293−301
[5]BealeS.Greengenesgleaned.TrendsPlantSci,2005,10:
309−312
[6]DongF-G（董凤高,ZhuX-D（朱旭东,XiongZ-M（熊阵民,
ChengS-H（程式华,SunZ-X（孙宗修,MinS-K（闵绍楷.
Breedingofaphoto-thermoperiodsensitivegeniemalesterilein-
dicaricewithapale-green-leafmarker.ChinRiceSci（中国水稻
科学,1995,9（2:
65−70（inChinesewithEnglishabstract[7]WuDX,ShuQY,XiaYW.Invitromutagenesisinducednovel
thermophotoperiodsensitivegenicmalesterileindicaricewithgreen-revertiblexanthanleafcolormarker.Euphytica,2002,123:
195−202
[8]YutakaS,RyouheiM,MinoruN,HiroyasuY,MakotoK.Men-
del’sgreencotyledongeneencodesapositiveregulatorofthe
水稻黄绿叶基因YGL4的遗传分析和分子定位1409
chlorophyll-degradingpathway.ProcNatlAcadSciUSA,2007,104:
14169−14174
[9]GongH-B（龚红兵,ChenL-M（陈亮明,DiaoL-P（刁立平,
ShengS-L（盛生兰,LinT-Z（林添资,YangT-N（杨图南,ZhangR-X（张荣铣,CaoS-Q（曹树青,ZhaiH-Q（翟虎渠,DaiX-B（戴新宾,LuW（陆巍,XuX-M（许晓明.Geneticanalysisofchlorophyll-blessmutantinriceanditsrelatedcharacteristics.
SciA
升级会员 