防止产生气泡的检测器的背压Word文档格式.docx
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的聚缩醛。
在pH3以下的酸性移动相时DERLINÒ
的将失去耐久性。
另外，在氨基酸分析系统中，由于要向清洗液通碱性水溶液，因此在使用BESPELÒ
的进样器时需要将密封改变为DERLINÒ
的。
希望您以正确的使用方法取得有价值的数据。
2．关于样品的注入
进样器有手动式和自动式的。
虽说近来系统的自动化急速发展，但主要使用的恐怕仍然是手动式的。
我想很多人都有这样的经历:
在用手动式注入试样进行分析时，标准曲线缺乏直线性，在色谱上出现不良的峰，等量注入了同样的试样而色谱峰的重现性却不好。
为什么会产生这样的毛病呢？
我想以7725型为例，只限于通过进样器的操作，考虑一下其原因及对策。
使用说明书上对于注入样品时的操作顺序是这样指示的。
①在把手柄处于进样的位置（以下称进样状态）时，使用附属的针口清洁器和注射器，注入清洗液（通常为移动相）清洗针口。
②将把手柄扳到load装填的位置（以下称装填状态），插入微量注射器。
③注入微量注射器内的样品。
④切到进样状态。
⑤在进样状态下拔出微量注射器。
在这一系列的操作中，①是非常重要的操作，这一步如有疏漏，便容易发生上面提到过的毛病。
这是由于进样器针口的污染可以认为是故障的主要原因。
请看附图。
图1所示是结束上述④的操作后之阶段上的针口。
如果在微量注射器的针尖上有样品粘附，或在针尖与进样器的定子面之间有间隙，则如红色所示将有样品残留。
如在此状态下进行⑤的操作，则残留的样品将扩散到整个针口（图2）。
如果在这里省去①而移到②的操作，则此样品将被挤入样品回路，产生所谓的交叉污染（图3）。
因此①的操作，即预先洗掉残留样品，这是防止故障的关键。
但是每次注入样品时都必须清洗针口，这又是件非常麻烦的事。
有没有多少方便些的办法呢？
这里可以考虑的是下面的顺序。
①进样状态时，插入微量注射器。
②转换到装填状态，注入微量注射器内的样品。
③转换回进样状态。
④在进样状态下拔出微量注射器。
与前面方法的不同之处在于：
是在装填状态下插入微量注射器，还是在进样状态下插入。
如果在进样状态下插入，则即使残留有前次注入的样品，它也将被挤出到排出管方向去，而不会引起交叉污染。
这个顺序在进样器的样品回路容量比较小（50ml以下）的时候是十分有效的方法。
由于过于注重色谱分析本身的性能好坏，对于注入样品的操作，可能考虑得较为简单，但从数据的可靠性这一观点来看，其实是一项非常重要的操作。
如上述那样，只要稍加用心，数据便会大不一样。
因此希望各位充分注意。
当然，关于试样注入的故障除了进样器的操作以外，还有起因为样品的称量错误及清洗错误，或者样品在微量注射器内壁上的吸咐等，以及微量注射器的操作有误的，关于这一类故障，希望在另外的机会里再作一说。
3．关于输液泵
在LC分析中因输液泵的故障而影响工作的经历，肯定有人是遭遇过的。
这里谈一谈泵的保养。
在泵的故障中，有些通过适当的使用原本是可以避免的。
这里首先举些这方面代表性的事例来看一下。
首先，故障起因于所使用溶剂的污染的情况颇为多见。
如果尘埃、垃圾等污染物进入输液流道内，则会引起配管的堵塞，单向阀的泄漏，或者柱塞密封等的损伤。
这类故障通过使用洁净的溶剂及容器多可以防止产生。
烧杯等口径较大的容器不注意清洁而持续使用，以及制得后隔了多日的蒸馏水等依旧使用，则也会由于混入污染物或者生水藻而引起这类故障。
在使用缓冲液（一旦干燥，便会析出硬的结晶）的场合，在分析完毕后如不及时作适当的处置，有时会引起很麻烦的故障。
如果在柱塞和密封附近有结晶析出，则会损伤这一部分。
因此，在做完使用了缓冲液的分析之后，如果其缓冲液是水溶液的话，请用水将流路充分洗净。
本公司的输液泵组LC-10Avp在构造上很容易清洗柱塞。
上面所说的都是为避免故障所作的，即所谓予防处置的代表性例子。
下面谈一下当故障实际上已发生时的情况。
这里仅就发生“流量降低”这一故障的情况时来谈。
不仅是“流量降低”，无论发生何种故障时，切实的办法都是流路的上游往下游，即从泵的入口起往出口顺次检查下去。
首先可能导致流量降低的原因是吸入口滤网的网眼堵塞。
在这种情况下，只要观察在入口处的特氟隆管子里流动的液体，便可看到有气泡产生，若增大流量，则看得更加明显。
正是由于这类气泡进入泵的扬程里，引起了流量的降低。
此外在将所用溶剂由水切换为甲醇之后，短时间内会产生气泡，但这是起因于溶解（在液休中的）空气，并非是网眼堵塞的故障。
这一请勿有误。
当吸入口滤网经长时间使用后产生网眼堵塞时，是其充分发挥了功能之后寿命已到，但如果多次频繁地发生此种网眼堵塞的话，则可以考虑是前述的溶剂污染。
使用注射器等以与通常相反的方向往吸入口滤网上通液，则可部分消除堵塞，在所更换的部件到来之前，作为应急措施不妨一试。
接着检验一下柱塞密封有无漏液情况。
当密封处存在漏液情况时需要更换密封，但当漏液不严重时，将泵扬程安装螺栓均匀地略加增紧，有时可消除漏液。
单向阀污染后，需要拆卸清洗。
单向阀集中了宝石球、球座、垫片等小零件，因此在分解时需要特别注意。
如果将宝石球、球座等用浸渍了异丙醇（溶剂）的纱布仔细擦拭，除去微小的垃圾污垢的话，单向阀的功能有可能恢复。
只是这种操作对于没有经验的人员来说或许有些麻烦，因此还是咨询维修服务人员为好。
4．柱温箱的任务
柱温箱用于使柱温度保持一定，其温度调节方式大致分来有以下这三种：
1．空气循环式
2．液浴式（水夹套式）
3．模块加热式
不论在何种分析中，当然都要求有①稳定性高，②灵敏度高，③重现性好。
出于这样的观点，这里就液体色谱（分离）法系统中，柱温箱的任务作一探讨。
●分析的重现性·
柱效率
在液体色谱法中，支配在柱内之分离的方式有①分配，②吸附，③离子交换，④尺寸排除等。
这些方式在于化学性的或者物理性的平衡状态，也依存于温度。
因此，通过稳定地保持柱温，可使平衡稳定化，在试样的分离，选择性，以及保留时间上得到良好的重现性。
一般来说，由于与ODS柱等分析方式的柱相比，离子交换柱更易于受到温度影响，因此温度调节更为重要。
溶剂的粘度 [mPa·
s]
温 度
20℃
50℃
水
1.002
0.547
甲 醇
0.611
0.426
另外，由于温度趋高的其目的成分与固定相的平衡将变快，因此一般来说柱效率将增长，峰更明晰，分离呈改善的倾向。
●柱的压力
如表所示，随着温度的升高，液体的粘度将降低。
因此，通过在高于室温的温度下进行分析，可以降低柱入口处的压力，控制给柱带来的负担。
尤其是在采用了耐压性低的聚合物系填料时，请注意在室温下将流量放低。
●分析的温度稳定性
示差检测器、电化学检测器、电导度检测器等一些检测器容易受到温度变化的影响，一旦由于室温变化使流动相温度变化，则基线将偏移或弯曲，不能进行稳定的分析，通过使柱温保持一定，也就是使流入检测器内的移动相温度保持一定，从而能够有稳定的分析。
根据各种检测器的不同，也有在柱温箱内装设有检测部分，提高部件的稳定性。
同时，在流动相以数十秒的高速通过柱时，由于仅靠柱温箱不能使移动相充分地保持一定温度，因此出于辅助的意义，需要在进样器与柱温箱之间的流路上安装予加热器。
另外，也有将进样器安装在柱温箱内的。
如上面说明的，通过采用柱温箱，可以得到各种不同的效果。
但是需要注意的是，如果将温箱温度提得过高，则会缩短柱的寿命，有时候会使柱的分离选择性变差。
5．防止产生气泡的“检测器的背压”
人们常说“向检测器加背压”，这里确认一下为什么、以及怎样来加吧。
在分析中会遇到这类情况并为之烦恼，即尽管泵在正常地输液，仍一再地由于产生气泡而致使基线紊乱（表1）。
产生气泡这一现象意味着一般地空气溶解于移动相的溶解度与在容器（reservoir）内时相比，在通过槽（cell）中时减少了。
溶解度的减少由下面的原因引起。
①移动相溶剂组成的变化：
在通过泵混合2种以上液体时（gradient梯度洗脱等）。
图1的实线表示氧气在水－甲醇混合液中的溶解度曲线。
由于此曲线低于连接各个在100%时溶解度的直线（虚线），因此其相差部份就变成气泡。
②温度上升：
移动相一经在柱温箱等处被加温，便容易产生气泡。
正好同将可乐加热后启封一样。
一经产生的气泡即使在室温下冷却，也不能马上再溶解。
③压力降低：
（此情况较少见）这第③项倒过来说就是意味着如果将通过槽时的压力提高到略高于常压的话，气泡就难以产生。
也就是说只要在检测器的背侧（下游侧）连接不锈钢管子等阻力管，施加压力就可以了。
当管子内径一定时，背压与下式成比例。
（但只在层流时）
（背压）¥
（溶解粘度）（流速）（管子长度）……
（1）式
下面说明一下各检测器可加多少背压。
表2例示了检测器的耐压，可参考。
在用通常的分析流量使用的场合，紫外检测器、电导检测器、萤光检测器的背压管推荐使用0.3mm内径×
2m长的管子。
用了此管后，在例如以1ml/min将水、甲醇进行了送液时，分别将约2.1Kgf/cm2的背压。
背压因溶剂的种类而不同是由于如
（1）式所示溶剂粘性起了作用。
通过使用这种背压管，在容易产生气泡的水－甲醇系gradient梯度洗提等之中也可以防止产生。
此外，在制备流量使用的场合，用同样背压管会使压力加得过大，因此请作变更，或截短管子，或放大管子内径（例如0.8mm内径）等。
在示差折光测器的情况下，请将移动相脱气（参照第10篇），或连接附件中的低背压管。
由于通常以一定的组成送液来使用，故以很小的背压就可以防止气泡。
此外在以60℃以上的高温使用柱的时候，可通过在紧靠检测器之处插入0.2mm内径×
1m的管子作为空冷阻力管等，以防止在柱－检测器之间产生气泡。
在电化检测器方面，在采用Ag/AgCl参照电极时，一般地由于没有那个耐压，所以不是加背压，而是要将移动相脱气。
如上所述，应注意考虑检测器的特性，防止产生气泡，以能进行良好的分析。
（1）但池耐压到7Kgf/cm2
（2）但只在用着Ag/AgCl参照电极时
6．有机溶剂的优与劣
在HPLC中最为频繁地使用的有机溶剂是甲醇和乙腈。
（这两者主要在反相色谱分析中使用），有时候使用优级的，但最好当然不是使用HPLC级的。
与优级相比，HPLC级的更多地除去了会吸收紫外线的杂质。
因此从检测、柱劣化等方面来看，HPLC级的更为理想。
从检测上说无论如何需要HPLC级的情况可以分为两种。
第一种情况是需要作微量检测，因此需要尽最大可能降低基线噪声。
第二种情况是根据gradient梯度洗提法进行分析时。
前者是因为有机溶剂中的杂质会使基线噪声增大，所以越是等级高的便越理想。
作为后者的一个例子，我们设想一个进行A、B两液（step）阶段梯度洗提法的情况来看看。
当A液中含有会吸附于柱中的杂质时，在A液流动的过程中杂质将浓缩在柱内。
从而会出现这种现象：
在其后切换到洗提力强的B液时其杂质被当作波峰观测，带来基线变动，引起测定障碍。
关于第一种情况，只要取得有机溶剂的紫外吸收光谱，就可以了解到在检测波长方面，采用了HPLC级的时候和采用了特级的时候，噪声程度有多少的不同。
图1是HPLC级甲醇与优级甲醇的比较。
图2是乙腈的优级与HPLC级的比较。
图3是吸附色谱分析中多采用的已烷的优级与HPLC级的比较。
各图中虚线是优级，实线是HPLC级的。
甲醇在测定波长区域中未见有太大的差别。
乙腈在短波长区域呈现出很大差别。
乙烷在短波长区域也能看到差异。
参照这些图，对于在以某个波长测定之际判断应使用哪一种将会有所帮助。
此外，尤其是在GPC中经常使用的有机溶剂中有THF（tetrahydrofuran）。
在一级的THF中作为过氧化物抑制剂含有BHT（butylatedhydroxytoluene）。
因为BHT有紫外吸收，所以会引起噪声程度加大。
HPLC级中不含BHT。
使用紫外吸光度检测器时建议使用HPLC级的。
三氯甲烷在GPC中也常被采用，但请注意有些等级的作为稳定剂添加有少量的乙醇。
使用有机溶剂时，请参考本文所叙，选择符合分析项目中溶剂的等级。
7．谈谈缓冲液
在使用于HPLC的移动相中，有的要在计算出磷酸二氢钠并溶解于水中之后，一边盯着pH计一边调整其pH值。
对这一麻烦的操作，我们常常一面调整一面在想：
要是只用蒸馏水便能分析就方便多了。
这种缓冲液（buffer）规定了溶液中的氢离子浓度，起着决定HPLC之分离的重要作用。
在由ODS柱的使用所代表的反相色谱分析中，抑制分析对象物之特定官能团的离子离解。
或者在积极地利用离解现象的离子pair对色谱法中决定其分离。
甚至在离子交换色谱法中，可以说正是移动相的pH才是分离的基本。
另外在水系GPC中，蛋白等仅以其分子的大小被分离，吸附、排斥等作用难以产生的pH被选出作为移动相。
这个缓冲液是怎样地被选出的呢？
先来看看缓冲液的性质吧。
缓冲液的pH由下式表示：
缓冲液是一种具有这种性质的溶液：
一般由弱酸与其盐构成，在其溶液中，当有例如其它的酸或碱加入之际，将保持pH与原来的值尽量相同。
当pH为pKa时，弱酸的离解成份与非离解成份的浓度将相等。
代表性弱酸的pKa为醋酸（4.8），柠檬酸（3.1,4.7,5.4），磷酸（2.1,7.2,12.3），氨（9.3）。
缓冲液的能力是所使用之弱酸盐的浓度越高则越大，还有pH越是接近所使用之弱酸的pKa附近也越大。
pH调在pKa的±
1程度的范围内应为适宜。
此外，在作成缓冲液之际，如果不是当量加入弱酸和其盐，而是在比例上作考虑的话，则也可以不必有使用pH计的微调。
现在来考虑一下缓冲液的设计上所必需的HPLC的特质吧。
首先必须从检测一侧来考虑。
假定现代是检测可见光的吸收的话，则上述的弱酸每种都能够使用。
但在以紫外的短波长，例如210nm作为检测波长时，醋酸、柠檬酸等由于其自身对210nm具有吸收，因而不能使用。
磷酸缓冲液在HPLC中多被采用，就是因为它对UV200nm以上不具有显著的吸收，故只要是通常的检测波长，不论何种皆可使用。
此外，在HPLC中，相对于导入的试样量，移动相的量要压倒性地多得多。
为此，移动相的每一单位量的缓冲能力小一些也就不要紧了。
在HPLC中，浓度为5mM或者2mM的buffer也有被使用的。
进一步从装置的保养上来看，盐是尽量稀为好，最好当然是没有。
稍许超出一下缓冲液的概念，作为移动相的pH调整用，有时加入一定量的醋酸、三氟醋酸。
它们没有pH调整的必要，因而其挥发性在装置保养上很为有益。
进而在将HPLC使用于制备时，试样的浓缩将变得容易。
如上所述，在将缓冲溶液用于移动相的场合，将要考虑其性质和HPLC的特质来设计。
各位是不是也再一次考虑一下自己的分析条件呢？
8．过滤篇
移动相和试样滤务必进行过滤，在除去不溶性粒子之后用于HPLC分析。
1．当移动相中含有了微粒子
将引起泵进口吸滤器的网眼堵塞。
由于这样一来即使泵抽吸液体也不再流动，因此气泡便会源源不断地向泵流去。
其结果将是泵不再送液。
此外，未被吸滤器捕获的微粒子会在泵的单向阀处制造麻烦。
就是说会由于微粒子的缘故使得泵的开闭状态不完全，从而使HPLC中最为基本的泵的定流量性被损坏。
微粒子甚至会在液道中的管路过滤器或柱进口处堵塞，引起故障。
2．当试样液中含有了微粒子
将引起柱的进口过滤器堵眼，使贵重的柱变得不再能使用。
3．微粒子常会混入
柱填料直径为5mm左右，柱进口过滤器孔径为2mm左右。
在HPLC中成为问题的微粒子是这种mm级的小物体。
不妨认定在制作移动相中使用的无机盐试剂里面肯定混有不溶性粒子。
此外在移动相制作、试样液的调制操作中也象这样常有微粒子混入进来。
4．过滤这样进行
移动相的过滤通常使用0.2- 0.45mm的膜滤器。
此膜滤器与架（Holder）一起使用。
在制作各种不同组成的移动相时过滤器用威氏滤瓶，可将收集器设置此中。
在大量地使用一定组成的移动相时，也可以将滤液直接接在5L、10L这样的大吸引瓶中，然后就用此容器直接分析。
减压一般使用吸气器（aspirator），但在水系液体的场合如使用真空泵则较短时间里可做完。
当然这 适当的水分捕集装置。
过滤试样液用的过滤器有不少在售。
过滤器的直径有4,13,25mm的，微粒子较多的应以用大直径的为好。
对于象桔子汁、绿茶这类微粒子多的液体，则更需要考虑将离心分离后上层清液再作过滤。
移动相、试样液的过滤器皆以耐药品性区分，皆需要按照有机溶剂的含量分开使用。
此外对离子色谱用的准备了无机离子洗提的过滤器。
9．关于脱气
脱气有以下两个目的。
①防止由气泡的产生引起的故障。
②防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的测定不稳定程度。
气泡会引发各种故障，如使泵的送液不稳，在检测器的基线上加进棘波状的杂波等。
尤其是在梯度洗提法的场合，由于混合溶液系的气体溶解度相对于溶液组成是非直线的，因此将会产生多量的气泡。
但是，如果只是为了不使气泡产生的话，可以将移动相事先用吸气器作减压脱气后使用，在耐压高的检测器的场合加背压以提高溶解度，可用这类简便的方法来处理。
问题是上面②的情况。
作为溶解气体量有显著作用的现象，我们知道以下这些情况。
ⓐ在差示折射率检测器上，由于移动相的折射率根据溶解气体量而变化，因此将产生基线的漂移及波动。
ⓑ用UV检测器进行短波长的高灵敏度分析之场合，由于溶解氧气在短波长区域会有吸收，因此一旦溶解氧气量变化，则产生基线的变动。
ⓒ在萤光检测器上，由于溶解氧气的消光作用，会出现信号减少的情况。
这里举一个例子。
图1是以差示折射率检测器RID－10A的基线变化反映了在已予先脱气的移动相中再溶解入空气的情形。
当空气一经再溶解，则折射率便将减少。
从RID－10A的最低range范围为2.5×
10－9RIUFS可以知道溶解在液体中的气体影响是非常之大的。
为了防止出现这样的不稳定，需要有较高的脱气能力而且稳定的脱气法。
在高灵敏度化进步的同时，脱气方法也变得重要起来。
现在主要有这两种方法：
A．He清除（purge）法
B．使用氟树脂膜的减压脱气法
A是将溶解入的空气置换为溶解度小的He的方法。
B方法是使氟树脂制管子的外侧保持减压状态，利用氟树脂的透过性，将分子尺寸较小的O2及N2排出到移动相之外。
图2所示的是市场供应的B型脱气装置的概略图。
A方法与B方法各有长短。
B法与A法相比，脱气能力差，容易受到外气温变动的影响，这是其短处。
但同时此法又有可不必使用He钢瓶、运转成本低，即使是含挥发性溶剂的混合溶剂也能够保持其组成的稳定这样的有利之点。
以前的He清除法装置由于是以一定的流量始终流着He气，因此有He气体的消费量多，在挥发性混合溶剂的情况下其组成将起变化的缺点，尤其是在使用对移动相的变化较敏感的差示折光检测器时，导致了基线漂移。
在这些方面作了改良的He脱气装置便是敝公司的产品DGU－1A。
其原理图如图3所示。
调压阀的压力设定到略高于大气压。
贮存器的构造是密封的。
最初一经打开排气阀，则He迅速地产生吹泡，溶解入的空气通过排气阀被排出。
在置换为He后，关闭排气阀。
贮存器内的He压经调压阀上升至所设定压力，He气停止向贮存器流动。
其后所供给的He气将只是补充因移动相被吸引向LC的泵后体积减少的部分。
因此，He消费量与过去相比减少了许多，且即使是挥发性的混合溶剂，一旦关闭排气阀之后，其组成也不会再出现变化。
重要的是应根据不同目的分别使用有效的脱气方法。
10．谈谈除蛋白
在HPLC中，对于试样最好是不作变动、尽量以原有的状态进行测定。
但根据情况不同，在注入HPLC之前有时要进行一些处理。
需要作前处理的是以下这些场合。
1．试样中含有会引起柱的劣化（填料的变性，柱压上升等）的物质时。
2．试样中有会在分离谱中作为峰出现，妨碍分析对象成份定量的夹杂物时。
3．需要调整试样中目的成份的浓度时
这里笔者打算就上例1中代表性的除蛋白做些说明。
蛋白一旦注入一般使用的柱（例如ODS）中，将会牢固在吸附于填料表面，而使填料性质起变化。
此外根据不同的移动相条件，还会由于所注入蛋白的变性降低溶解性，从而使柱堵塞。
因此，在注入之前需要从试样中除去蛋白。
这一操作叫做除蛋白。
除蛋白的方法有以下这些。
（1）通过有机溶剂、酸、热使之变性后离心沉淀除去的方法。
图1所示的是作为通过乙腈、甲醇等有机溶剂进行离心沉淀除去的例子，在血清中抗痉挛药分析时的除蛋白方法。
由于此方法操作较为简单，因此多被采用。
且其酸用的是高氯酸、三氯醋酸、5－磺酸基水杨酸等。
（2）采用不与水混和的有机溶剂抽出分析对象物的方法（液相抽出）。
操作稍显复杂，但具有还能够在某种程度上除去蛋白以外的夹杂物，以及通过采集有机溶剂层后蒸发干固，可以浓缩的特长。
在分析血清中的类固醇时在血清中添加二氯甲烷，抽出类固醇的操作等就与此相等。
（3）通过固相
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