第十五节 多聚酶链式反应扩增DNA片段Word文件下载.docx

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四种脱氧核苷酸

合成DNA子链的原料

酶

解旋酶

DNA聚合酶

打开DNA双螺旋

催化合成DNA子链

能量

ATP

为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的3′端起点

（二）细胞内DNA复制过程

1、DNA的反向平行结构：

（1）核苷酸分子的结构与方向性：

（2）DNA分子的平面结构：

2、DNA聚合酶的特性：

　　DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。

因此，DNA复制需要引物。

3、DNA合成的方向：

5′→3′合成

（三）PCR的原理

1、DNA分子的热变性原理：

2、体外DNA复制的条件（PCR反应的条件）

①DNA模板；

②四种脱氧核苷酸；

③两种引物：

分别与两条模板链相结合；

④耐高温的聚合酶（不需解旋酶）；

⑤缓冲液：

模拟核基质，维持pH基本不变；

⑥温控设备：

严格控制温度（PCR仪）。

3、PCR的反应过程

（1）三个基本步骤——变性、复性和延伸。

（2）反应循环数：

25—30。

（3）扩增倍数：

106—109。

第一轮反应：

4、循环特点

①上一次循环的产物为下一循环的模板；

②子代DNA中只有2个DNA含有最初母链的一条；

③其它子代DNA分子都为双引物形式；

④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×

2N。

二、实验操作

1、PCR反应体系：

缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水。

2、操作步骤

　　①（准备）按配方将所需试剂摆放在实验桌上；

　　②（移液）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分；

　　③（混合）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁；

　　④（离心）将微量离心管放在离心机上；

　　⑤（反应）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

三、操作提示

1、避免外源DNA污染：

所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

2、缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

3、在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。

　　目的：

避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。

四、结果分析与评价

1、DNA含量的测定原理：

　　DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。

可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。

2、具体方法

　　①将样品进行50倍稀释：

取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水。

　　②以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。

　　③加入步骤1中的DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。

　　④根据下面的公式计算DNA含量：

　　DNA含量（μg/ml）=50×

（260nm的读数）×

稀释倍数

课堂小结：

-返回-

同步测试

一、选择题

1、DNA分子复制时，解旋的两条链中（　）

A．仅一条作为复制模板

B．两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子

C．两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子

D．两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子

2、下列关于DNA复制过程的正确顺序是（　）

①互补碱基对之间氢键断裂

②互补碱基对之间形成氢键

③DNA分子在解旋酶的作用下解旋

④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对

⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构

A．①③④②⑤　　　　　　　　　B．①④②⑤③

C．①③⑤④②　　　　　　　　　D．③①④②⑤

3、下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（　）

①DNA复制　　②RNA复制　　③转录　　④翻译　　⑤逆转录

A．①②③④⑤　　　　　　　　B．①②③④

C．①②③⑤　　　　　　　　　D．①③④⑤

4、实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（　）

①酶　　　②游离的脱氧核苷酸　　③ATP　　　　　　④DNA分子

⑤mRNA　　⑥tRNA　　　　　　　　⑦适宜的温度　　⑧适宜的酸碱度

A．①②③④⑤⑥　　　　　　　　B．②③④⑤⑥⑦

C．②③④⑤⑦⑧　　　　　　　　D．①②③④⑦⑧

5、利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？

（　）

A．2　　　　　　　　　　　　　B．4

C．8　　　　　　　　　　　　　D．16

6、关于DNA分子的叙述中，正确的是（　）

A．DNA的两条链是极性相同，同向平行

B．DNA的两条链是极性相同，反向平行

C．DNA的两条链中极性不同，反向平行的

D．DNA的两条链是极性不同，同向平行

7、假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（　）

A．215　　　　　　　　　　　　B．230

C．260　　　　　　　　　　　　D．231

8、DNA的合成方向总是（　）延伸。

A．从DNA分子的左端向右端

B．从DNA分子的右端向左端

C．从子链的5′端向3′端

D．从子链的3′端向5′端

9、要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（　）

A．氧气的浓度　　　　　　　　B．酸碱度

C．温度　　　　　　　　　　　D．大气的湿度

10、DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（　）

A．模板母链相同　　　　　　　B．非模板母链相同

C．两条模板母链相同　　　　　D．两条模板母链都不相同

11、在（　）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开。

A．10－20℃　　　　　　　　　B．80－100℃

C．20－30℃　　　　　　　　　D．40－60℃

12、关于DNA的复制，下列叙述正确的是（　）

A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链

B．DNA复制不需要引物

C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸

13、下列有关PCR描述，不正确的是（　）

A．是一种酶促反应

B．引物决定了扩增的特异性

C．扩增对象是DNA序列

D．扩增对象是氨基酸序列

CDADACBCCBBCD

二、非选择题

14、PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。

请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：

（1）PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：

____________________。

（2）在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要__________、和__________、__________等条件。

　　（3）某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是__________和__________个。

显示答案

　　14、

（1）DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对

（2）四种脱氧核苷酸、能量、酶

　　（3）245、315

-END-

课外拓展

PCR的常见问题

　　PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。

出现假阴性结果的常见原因有：

TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；

引物设计不合理；

提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；

循环次数不够；

等等。

当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循环。

为了防止假阴性结果的出现，在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。

同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。

尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。

PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′端与靶基因互补。

　　PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。

此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。

为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：

隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。

高考解析

例1、新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。

下列技术（或仪器）与应用匹配正确的是（　）

A．PCR技术——扩增蛋白质

B．杂交瘤技术——制备单克隆抗体

C．光学显微镜——观察叶绿体的基粒

D．花粉离体培养——培育单倍体植物

答案：

BD

解析：

　　本题主要考查学生的理解能力。

PCR技术只能用来扩增核酸，不能用来扩增蛋白质；

利用光学显微镜无法观察到叶绿体。

例2、请回答基因工程方面的有关问题：

（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。

图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_________。

（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。

某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。

①第1组：

____________________________；

②第2组：

_____________________。

（3）用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图（1kb即1000个碱基对），请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。

（1）15/16

（2）①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　　②引物Ⅰ’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

　　　（3）见下图