第十五节 多聚酶链式反应扩增DNA片段Word文件下载.docx

1、四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点（二）细胞内DNA复制过程1、DNA的反向平行结构：（1）核苷酸分子的结构与方向性：（2）DNA分子的平面结构：2、DNA聚合酶的特性：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。3、DNA合成的方向：53合成（三）PCR的原理1、DNA 分子的热变性原理：2、体外DNA复制的条件（PCR 反应的条件）DNA模板；四种脱氧核苷酸；两种引物：分别与两条模板链相结合；耐高温的聚合酶（不需解旋酶）

2、；缓冲液：模拟核基质，维持pH基本不变；温控设备：严格控制温度（PCR仪）。3、PCR的反应过程（1）三个基本步骤变性、复性和延伸。（2）反应循环数：2530。（3）扩增倍数：106109。第一轮反应：4、循环特点上一次循环的产物为下一循环的模板；子代DNA中只有2个DNA含有最初母链的一条；其它子代DNA分子都为双引物形式；处于两引物之间的DNA序列呈指数增长12N。二、实验操作1、PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水。2、操作步骤（准备）按配方将所需试剂摆放在实验桌上；（移液）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分；（混合）

3、盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁；（离心）将微量离心管放在离心机上；（反应）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。三、操作提示1、避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。2、缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3、在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。目的：避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。

4、四、结果分析与评价1、DNA含量的测定原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。2、具体方法将样品进行50倍稀释：取2LPCR反应液，加入98L蒸馏水。以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。根据下面的公式计算DNA含量：DNA含量（g/ml）=50 （260nm的读数）稀释倍数课堂小结：- 返回 -同步测试一、选择题1、DNA分子复制时，解旋的两条链中（）A仅一条作为复制模板B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C两条链作

5、为模板并复制出两个相同的DNA分子D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子2、下列关于DNA复制过程的正确顺序是（）互补碱基对之间氢键断裂互补碱基对之间形成氢键DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对子链与母链盘旋成双螺旋状结构ABCD3、下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（）DNA复制RNA复制转录翻译逆转录A BC D4、实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（）酶游离的脱氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA适宜的温度 适宜的酸碱度ABCD5、利用PCR技术，把一个双链DN

6、A分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（）A2 B4C8 D166、关于DNA分子的叙述中，正确的是（）ADNA的两条链是极性相同，同向平行BDNA的两条链是极性相同，反向平行CDNA的两条链中极性不同，反向平行的DDNA的两条链是极性不同，同向平行7、假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（）A215B230C260D2318、DNA的合成方向总是（）延伸。A从DNA分子的左端向右端B从DNA分子的右端向左端C从子链的5端向3端D从子链的3端向5端9、要使PCR反应在体外的条件下顺

7、利地进行，需要严格的控制（）A氧气的浓度B酸碱度C温度D大气的湿度10、DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（）A模板母链相同B非模板母链相同C两条模板母链相同D两条模板母链都不相同11、在（）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开。A1020B80100C2030D406012、关于DNA的复制，下列叙述正确的是（）ADNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链BDNA复制不需要引物C引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合DDNA的合成方向总是从子链的3端向5端延伸13、下列有关PCR描述，不正确的是（）A是一种酶促反应B引物决定了扩增的特异

8、性C扩增对象是DNA序列D扩增对象是氨基酸序列CDADAC BCCBBCD二、非选择题14、PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：（1）PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：_。（2）在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要_、和_、_等条件。（3）某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱

9、氧核苷酸的数目分别是_和_个。显示答案14、（1）DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对（2）四种脱氧核苷酸、能量、酶（3）245、315-END-课外拓展PCR的常见问题PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶，并增加510次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时

10、，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3端与靶基因互补。PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。高考解析例1、新技术的建立和应用对生物学发展至关重要

11、。下列技术（或仪器）与应用匹配正确的是（）APCR技术扩增蛋白质B杂交瘤技术制备单克隆抗体C光学显微镜观察叶绿体的基粒D花粉离体培养培育单倍体植物答案：BD解析：本题主要考查学生的理解能力。PCR技术只能用来扩增核酸，不能用来扩增蛋白质；利用光学显微镜无法观察到叶绿体。例2、请回答基因工程方面的有关问题：（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_。（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。第1组：_ ；第2组：_。（3）用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图（1 kb即1000个碱基对），请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。（1）15/16（2）引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效（3）见下图