蔗糖酶的提取及活力Word文档下载推荐.docx
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1.2.1，材料：
啤酒酵母；
醋酸钠；
甲苯；
4mol/L醋酸；
95%乙醇；
0.5mol/Lris-HClPH7.3缓冲液；
锥形瓶；
量筒；
烧杯；
具塞试管；
吸球；
培养箱；
恒温水浴锅；
磁力搅拌器；
搅拌子；
高速冷冻离心机；
1.2.2，方法：
1.2.2.1,酵母自溶：
⏹250毫升锥形瓶,加入20克鲜酵母
⏹加入醋酸钠1.6克，搅拌使团块的酵母液化
⏹加1.5毫升甲苯，包扎好瓶口，摇动10分钟，使充分混匀
⏹放入37℃培养箱，保温48-60小时，使酵母自溶
1.2.2.2,初提液A制备.
⏹在培养箱中取出装有已自溶酵母的三角瓶，加10毫升蒸馏水，摇匀，倒入离心管1中，平衡（互加平衡）。
⏹用高速冷冻离心机4℃，15000r／min离心10min。
⏹离心管中的悬浮液分三层，上层为浆状物（甲苯及其抽提物），下层为固体（细胞碎片沉淀），中间一层为液体（含酶）。
⏹小心仔细地取出中间层的液体，重新倒入离心管2中，4℃，15000r／min离心10min（互加平衡）。
⏹取上清液倒入
⏹25毫升量筒
⏹量体积记录VA
⏹取出3ml保存
⏹得初提液A
1.2.2.3,热提取液B制备:
⏹将初提液A（VA-3ml）倒入50毫升的三角瓶中，加4mol/L的醋酸3.2ml左右，使溶液的pH值约为4.5左右，摇匀
⏹50℃恒温水浴中保温25min（注意温度绝对不能超过50℃），在保温过程中不断的摇动三角瓶
⏹离心：
4℃，15000rpm，10min
⏹（H2O平衡）
⏹仔细地倒出上层清液入10ml量筒测量体积，记为VB，此提取液为热提取液B。
⏹取出3ml于具塞试管保存，用于后续实验。
1.2.2.4,乙醇沉淀提取液C制备
⏹将热提取液B（VB-3ml）倒入100ml的烧杯中，放入加有碎冰的大烧杯冰浴，置于磁力搅拌器上，缓慢加入体积（VB-3ml）-20℃95%乙醇。
整个过程不少于25min，结束后再继续搅拌5min
⏹将烧杯内的液体全部移入离心管中，杯底白色固体保留待用，4℃，15000rpm,离心10min加（95%÷
2）乙醇平衡。
离心后弃去上清液
⏹用5毫升trisHCL溶解烧杯中的白色固体，再倒入离心管中搅拌使管内的固体溶解，再次离心，4℃，15000rpm,10min,平衡用trisHCL溶液平衡
⏹离心后取上层清液入10ml量筒
⏹测量体积，记为VC
⏹此提取液为乙醇沉淀提取液C
⏹测量其体积为VC。
全部保存于具塞试管，用于后续实验。
1.3,结果与讨论
实验得到ABC各三种不同程度纯化的蔗糖酶提取液，颜色各从深及浅，说明蔗糖酶本身的颜色较浅。
初提液A
热提取液B
乙醇沉淀提取液C
溶液体系
水溶液
醋酸
trisHCl
特点
pH值4.5左右
pH值7.3左右
体积/ml
18.5
17.5
5.6
颜色状态
黄色溶液
淡黄色溶液
影响因素
温度、酸碱度控制不准会影响蔗糖酶产量
1.4,结论
实验中在将提取液A水浴时必须不断摇动锥形瓶，温度不能超过50℃，取出后迅速在水浴中冷却，之后所有的操作都必须在冰浴上。
而在提取液B放入乙醇时，必须要保证乙醇的速度缓慢，是乙醇混合均匀，析出最大量的沉淀使所需酶充分变性沉淀。
整个操作必须严谨细心，保证蔗糖酶得到了最优纯化。
提纯酶时可以充分利用蛋白质的变性、复兴的性质来得到纯化的酶液。
2,蔗糖酶的纯化QSepharose-柱层析法
2.1文献综述：
通过对不同离子交换层析方法的比较,进行酵母蔗糖酶纯化实验改进,采用QSepharose离子交换介质;
流动相经50min由0.05MTris-HCLpH7.3缓冲液到1MNaCL的0.05MTris-HCLpH7.3缓冲液,进行梯度洗脱分离,分离效果最好,蔗糖酶与杂蛋白得到了有效的分离,回收率为93.2%,是现有实验的3.17倍,浓缩倍数为2.91,是现有实验的1.43倍,提高了实验效果。
离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究）
2.2,材料与方法
2.2.1,材料
⏹试剂：
0.05mol/LTris-HClPH7.3缓冲液；
1mol/LNaCl和0.05mol/LTris-HClPH7.3缓冲液;
0.5mol/LnaOH;
QSepharose
⏹器具：
层析柱、梯度发生器及搅拌子、紫外分光光度计、点滴板等
2.2,.2,方法
2.2.2.1,离子交换柱的填充
⏹固定和清洗：
层析冲洗。
下面留一点水。
柱子垂直固定，下端的橡皮管夹子夹紧、取下上部盖子，加水5毫升
⏹凝胶装柱：
高约5公分，上面填平，注意上部水面高于交换剂平面，放松夹子，使水流下，直到与表面相切，夹紧夹子。
2.2.2.2,缓冲液盐度梯度发生器的安装
⏹连通：
先加入水，两个旋钮朝一个方向可以连通，使液体进入，连接桥不可以有气泡。
然后使旋钮回到正中，加入相应的溶液。
⏹装入溶液：
第一个杯子加入20毫升0.05摩尔/升TrisHClpH7.3，并加入磁力棒，第二个加入20毫升1摩尔/升NaCl
2.2.2.3,柱的平衡
⏹在小烧杯中加入15毫升TrisHCl
⏹恒流泵进口插入烧杯液面下
⏹恒流泵出水管一端连接柱子
⏹放松夹子
⏹打开恒流泵
⏹用TrisHCl冲洗
⏹直到缓冲液面与交换剂相切
2.2.2.4,加样及洗穿透峰：
⏹夹紧下端夹子,在烧杯加入15毫升TrisHCl
⏹从上部缓慢加入0.5ml提取液C，放松夹子
⏹样品全部刚好进入交换剂内，相切，夹紧夹子
⏹先打开恒流泵，再放开夹子
⏹用量筒收集全部流出液体，每管收集3ml
⏹直到液面相切
2.2.2.5,氯离子梯度洗脱
⏹将梯度发生器出口与恒流泵相连
⏹恒流泵与柱相连
⏹③打开搅拌器，打开连通器旋钮，打开恒流泵
⏹④用20毫升TrisHCl缓冲液配制的
⏹1摩尔/升NaCl20毫升溶液
⏹开始梯度洗脱
⏹打开夹子
⏹⑤用量筒收集3毫升/管，
⏹直到全部缓冲液流出
2.2.2.6,离子交换剂的再生
⏹烧杯加入15毫升NaCl洗脱→不用收集→凝胶冲到小烧杯→全部凝胶回收
⏹最后一个班用0.5摩尔/升NaOH洗3CV，除去氯离子，不用回收洗脱液→最后凝胶回收，冲到烧杯里面
2.2.2.7,用紫外分光光度计测每管的紫外吸光度OD值，并记录。
测定后样品回收!
!
2.2.2.8,酶活力测试
⏹样品选取（老师指导下）
⏹从洗穿透峰样品中选择1-2个蛋白质浓度较高的样品测定酶活力
⏹从梯度洗脱样品中选取峰值附近的几个样品进行酶活力测定。
⏹酶活力测定：
点滴板中滴2滴5%蔗糖→加2滴待测洗脱液→玻璃棒搅匀→放置5min→浸入葡萄糖试纸→1s（延长时间）取出→过60s比较颜色深浅→用“+”表示酶活力的大小
⏹体积测定
⏹将酶活力较高的2-3个样品合并测量体积（洗穿透峰样品不用合并），记为VD，用具塞试管保留，其他样品可以洗掉。
2.3,结果与讨论
取酶活力最高的9、10、14合并为一管，记为提取液D。
与实验一中获得的ABC一起放入冰箱中保存。
提取液D
5.4
无色溶液
2.4，结论
提取液C中除了高活性酶外，还有各种不同的杂蛋白质。
实验中应注意各种实验操作，在填充柱时要注意不要干柱，全部凝胶要回收归还。
整个实验过程都要保证不要干柱。
在安装缓冲液梯度发生器时，要注意打开后观察两个杯子中液体是否均有减少，连接桥不能有气泡。
确保梯度浓度制成。
3，蔗糖酶活力的测定
a）3.1，文献综述:
在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定，可用DNS比色法测定还原糖的含量，可用DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力.。
3.2，材料与方法
3.2.1，材料
⏹试剂3、5-二硝基水杨酸；
葡萄糖标准溶液0.2mg/ml；
0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6；
5%蔗糖用0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6配置；
2mol/LNaOH
⏹器材：
电炉；
分光光度计；
试管、移液管
3.2.2，方法
3.2.2.1，葡萄糖标准曲线制作
⏹烧水，不要太多
⏹DNS反应：
注意振荡混匀，移液管对应，要及时清洗
试管号
1
2
3
4
5
葡萄糖/ml
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
蒸馏水/ml
3.0
2.2
2.0
1.8
DNS/ml
1.5
总体积/ml
4.5
⏹测吸光值
⏹于540波长处测OD值。
用0号做对照。
⏹测定要求：
测定数据在（0.1-0.7A），波动可以到0.2-0.8，最小不能小于0.1，最大不能超过1.0。
⏹绘制葡萄糖标准曲线：
以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出葡萄糖标准曲线。
数据结果回去处理。
⏹要求R2值接近1，至少0.999。
3.2.2.2,酶活力测定
⏹稀释样品：
⏹稀释方法：
提取液
A
B
C
D
比例
1：
200
20
移液管原液
0.25ml
0.5ml
定容
50ml容量瓶
10ml移液管
⏹稀释顺序：
浓度从低到高，即C→B→A，防止污染。
⏹水解反应
试管
项目
A0
A1
B0
B1
C0
C1
D0
D1
酶液A稀释液
各取4种稀释液2.00ml，加入8支试管，按项目名称编号
NaOHml变性
0.5
---
预热
5%蔗糖试剂瓶，8支试管（放在试管架上），于35℃预热10min
蔗糖ml
各试管加入5%蔗糖2ml加入后立即摇匀开始计时，
35℃准确反应3min
NaOH终止反应
总体积/ml
4.50
3.2.2.3,进行DNS反应，测吸光值
试管号/ml
反应液V测
0.1
0.15
0.3
从上次水解反应液中分别取出V测，用ABCD移液管，先取对照
蒸馏水
2.9
2.85
2.7
DNS
1.50
总体积
⏹调零：
以A0、BO、C0、D0分别作对照调平。
每组需重新调平。
⏹测过的样品不要倒掉。
⏹如果测得的OD值结果不在标准曲线还原糖范围内，则可增加或减少取样量，加倍或减半，重新做DNS反应，直到OD值在标准曲线范围内为止（0.1-1.0之间）。
⏹吸光值结果分别代入葡萄糖曲线公式，计算4.5ml溶液中所含还原糖的量（以葡萄糖计），用表格记下。
3.2.2.4,计算出酶活力单位
3.3,结果与讨论
此曲线的线性程度只有0.9943，线性程度不是很高，可能在试剂量取时存在着一些人为视读误差。
样品
V测/ml
OD540/A
0.812
0.594
0.578
0.825
葡萄糖/mg
0.390
0.308
0.301
0.394
总体积/mg
稀释倍数
酶活力单位/U
5265.0
2494.8
2031.8
265.9
酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提液A的总酶活）*100
表蔗糖酶活力测定结果
项目
乙醇提取液
柱分离液D
总活力单位/U
回收率/%
100
47.4
38.6
5.1
3.4，结论
A的酶活力最高，B的酶活力较高，回收率也较高，C、D依次降低，D的酶活力和回收率都较低，实验时，温度、PH等条件的控制不当都会给结果带来误差。
A的酶活力及回收率都较高，BCD依次降低，说明随着纯化的越来越高，酶活力变低。
4，蔗糖酶蛋白质含量测定
a）4.1，文献综述:
凡含有两个及两个以上肽键（—CO—NH—）的化合物（如双缩脲：
H2N—CO—NH—CO—NH2），在碱性溶液中（如Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物；
蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质复合物；
铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比；
在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选用本方法。
4.2，材料与方法
4.2.1材料
试剂A：
碱性铜试剂（碱性）；
试剂B：
酚试剂，黄色试剂，保存在棕色瓶中；
标准浓度牛血清白蛋白溶液（200ug/ml）；
Na2WO4·
2H2O；
Na2MoO4·
85%H3PO4；
浓HCl；
Li2SO4·
H2O；
溴水；
酚酞指示剂；
Na2CO3；
NaOH；
CuSO4·
5H2O；
酒石酸钾钠；
牛血清白蛋白。
所用试剂均为化学纯或分析纯。
①721分光光度计②刻度吸管0.5ml（*1），2ml*2，5ml*1③试管1.5cm*15cm（*8）④恒温水浴槽
4.2.2，方法
4.2.2.1蛋白质含量标准曲线绘制
⏹Folin-酚反应
所加试剂/ml
管号
标准牛血清蛋白液/ml
0.2
0.4
0.6
水/ml
4.3
4.1
3.9
3.7
3.5
试剂A/ml
摇匀，静置10min
试剂B/ml
第一次
立即迅速充分混合，加一管摇一管，静置10分钟
第二次
立即迅速充分混合，加一管摇一管，55℃5min，注意水浴锅水位足够，取出试管置于冷水冷却1Min
6.0
OD660
⏹测吸光值：
OD660nm；
0号试管作对照
⏹绘制标准曲线：
横坐标为标准蛋白质微克数，纵坐标为吸光值。
⏹未知蛋白质浓度测定
样品稀释
稀释比例
1:
1:
稀释方法
0.5ml原液：
50ml容量瓶
0.5ml原液+
9.5ml移液管量取
不稀释
测样品蛋白含量
试剂量/ml
所加试剂
样品稀释液/ml
移液管：
酶液
1/20Tris
0.5ml
Tris3ml
4.0
试剂A
试剂B
OD660nm/A
4.3，结果与讨论
各样品测定结果表
管号
0.414
0.224
0.406
0.155
蛋白含量/mg
0.116
0.058
0.106
0.038
总蛋白/mg
139.2
96.00
30.24
0.0760
比活力（U/mg）
37.8
26.0
67.2
3498.7
各提取液酶活力等比较
总酶活/U
总蛋白/mg
比活力/U/mg
蛋白回收率%
酶活回收率%
纯化倍数/倍
5265
96.0
69.0
0.69
乙醇提取液C
30.23
21.7
1.78
0.456
0.33
92.56
标准曲线线性程度不是很高，可能由于移液时产生误差或放试剂B时没有严格控制时间，混合不够充分。
纯化倍数逐渐提升，但第二组比较低，可能由于第二组的纯化时，操作产生了误差。
4.4结论
本次实验利用了Folin-酚原理，该实验方法灵敏度高，但蛋白质浓度和光密度的线性关系不够严格，而且不同的蛋白质的Tyr和Typ含量不同，显色程度也会有差异，所以造成了实验的一些误差，使制作的曲线线性程度不够，且B的纯化倍数<
1.另实验中的一些操作不规范，也可能导致实验结果产生误差，故在实验中必须规范实验操做，仔细滴加试剂，减小实验误差。
5，微量凯氏定氮法测总蛋白氮
5.1，文献综述:
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
（参考文献：
微量凯氏定氮法测定食品中粗蛋白的含量）
5.2，材料与方法
5.2.1，材料
（1）蛋白样品：
2g牛血清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100
（2）98%浓硫酸。
（3）硫酸钾3份与硫酸铜1份（w/w）混合研磨成粉末。
（4）30%NaOH溶液：
30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。
（5）2%硼酸溶液：
2g溶于蒸馏水，稀释至100ml。
（6）混合指示剂：
0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%
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