全国优秀博士学位论文Word文件下载.docx

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本学位论文成功地揭示了细菌中dnd基因簇可以将硫原子整合到DNA的磷酸骨架上,形成序列特异性、空间构象专一性的磷硫酰化修饰，揭示这种特异的生理修饰存在于不同的细菌中,并导致了电泳过程中的DNA降解表型。

DNA降解表型（DNAdegradation，Dnd）最初是从变铅青链霉菌中观察到的：

电泳过程中，变铅青链霉菌的染色体不再是清晰的DNA条带，而是呈现降解状态。

进一步研究发现，这是由于DNA上发生了一种异常的复制后修饰，导致DNA在电泳过程中容易遭受阳极产生的Tris过酸衍生物位点特异性攻击而产生双链切割反应。

最近，研究者发现，这种异常修饰实际上是与dnd基因簇相关的DNA硫修饰。

通过放射性35S喂养，在具有dnd同源基因簇/Dnd表型的变铅青链霉菌66，阿维链霉菌NRRL8165和荧光假单胞菌Pf0-1的DNA上检测到放射性硫信号，揭示出除了碳、氢、氧、氮和磷，DNA上还存在第六种元素——硫。

本研究首先通过35S半胱氨酸喂养具有dnd同源基因簇/Dnd表型的基因工程大肠杆菌，并分离到放射性硫标记的基因组DNA。

随后，把基因组DNA酶解、去磷酸化成单脱氧核糖核苷，并利用高压液相色谱分离，结合液体闪烁计数器对每分钟分离组分的放射性强度进行检测，从而对硫修饰DNA分子的保留时间进行了精确定位，由此展开了对这种“前所未见”的硫修饰DNA化学结构的探索。

基于硫修饰DNA分子在高压液相色谱中的“位置”，继而采用高压液相色谱-质谱联用技术对其组分进行分析，发现了一组可能来自硫修饰DNA分子特征性质谱信号597，446，348，152和136。

其中，152是特征性的带有一个正电荷的鸟嘌呤碱基（G）的核质比；

136则是特征性的带有一个正电荷的腺嘌呤碱基（A）的核质比。

提示我们在经过核酸酶的酶切后，可能的硫修饰分子仍然同时包含腺嘌呤和鸟嘌呤。

结合这组核质比信号以及该分子对核酸酶具有抗性的特征，提出DNA分子的硫修饰可能发生在DNA骨架上，磷酸二酯键发生磷硫酰化成为硫代磷酸二酯键，并存在于脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间，即5'

-d（GPSA）-3'

或者5'

-d（APSG）-3'

，暗示DNA硫修饰不像人们最初预料的那样发生在相对活跃的DNA碱基上。

对基因工程大肠杆菌中硫修饰DNA分子和合成标准品进行了高压液相色谱-质谱联用、高精度质谱、紫外特征吸收色谱以及四级质谱断裂模式对比分析，最终揭示出DNA硫修饰的化学本质，证实基因工程大肠杆菌中硫修饰DNA分子的确以硫代磷酸二酯键的方式、按5'

-3'

的方向序列特异性发生在脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间——5'

。

进一步利用对底物具有空间构象选择性的核酸酶对大肠杆菌中硫修饰DNA分子5'

进行水解；

结合其在高压液相色谱中的保留时间提出DNA硫修饰不但具有序列选择性，还具有空间构象专一性，特异性地以RP构象存在。

在Dnd表型的发现菌变铅青链霉菌中，利用放射性硫标记、高压液相色谱-质谱、紫外特征吸收色谱以及高精度质谱分析，发现DNA硫修饰在不同菌属中具有不同的序列选择性。

不同于大肠杆菌中的5'

RP，链霉菌的DNA硫修饰同样以硫代磷酸二酯键形式、RP空间构象存在，但序列特异性不同，发生在两个脱氧鸟苷之间——5'

-d（GPSG）-3'

目前已经在100多种微生物中观察到Dnd表型，并在许多广泛分布的细菌中检测到dnd同源基因簇的存在。

通过对来自截然不同栖息地的厌氧菌GeobacteruraniumreducensRf4、遍在远洋杆菌CandidatusPelagibacterubiqueHTCC1002、荧光假单胞菌PseudomonasfluorescensPf0-1、希瓦氏菌ShewanellapealeanaATCC700345、海洋细菌HahellachejuensisKCTC2396，以及海洋杆菌Oceanobactersp.RED65进行序列比对发现这些细菌的基因组中都具有dnd同源基因簇，包含5个或4个dnd同源基因。

结合高压液相色谱-质谱联用分析，逐一鉴定出这些细菌都发生了DNA硫修饰，都以5'

RP或者5'

RP的方式在DNA骨架上发生磷硫酰化。

说明DNA硫修饰不是偶然发生的生命现象，是广泛存在的具有序列选择性、空间构象专一性的新型修饰系统。

体外化学合成的硫代磷酸二酯键对很多核酸酶的酶解作用具有抗性，结合DNA硫修饰是一种复制后修饰、序列特异性、空间构象专一性的生理特性，提出硫修饰很可能是细菌的一种自我保护机制，通过对自身DNA进行磷硫酰化修饰，保护DNA免受某些核酸酶的酶解；

另外，细菌还可以利用硫修饰为标志对自身和外源DNA进行区分，针对性地分辨、清除入侵的DNA分子，维护自身的遗传稳定性。

dnd系统是被多种细菌所采纳、代表着完全不同于DNA甲基化的新型DNA修饰体系。

本学位论文还揭示了DNA磷硫酰化硫修饰导致了Dnd表型（电泳过程中的DNA降解）。

磷硫酰化的DNA由于受到电泳液中氧化物质的攻击而导致DNA骨架在磷硫酰化修饰处发生断裂，进而导致降解现象。

本学位论文完成了对变铅青链霉菌dnd基因簇中的DndB、DndC和DndE蛋白的超量表达和纯化，以及对DndA蛋白活性半胱氨酸的定点突变，为下游酶学功能的探索奠定了基础。

综上所述，DNA硫修饰的本质是DNA骨架上序列特异性、空间构象专一性的磷硫酰化修饰，DNA硫修饰是一种不同于甲基化的新型的DNA修饰体系。

DNA硫修饰是迄今为止国际上唯一发现的发生在DNA骨架上的生理修饰。

关键词：

DNA降解，dnd基因簇，DNA硫修饰，磷硫酰化，硫代磷酸二酯键

DNAsulfurmodification-phosphorothioationofDNAbackbonebybacterialdndgenes

WangLianrong

ABSTRACT

TheDNAdegradation（Dnd）phenotypewasoriginallyobservedduringelectrophoresisofgenomicDNAfromStreptomyceslividansandwasthoughttoinvolveapost-replicativeDNAmodificationthatreactedwithaperacidderivativeofTrisformedattheelectrophoreticanode.ThisphenotypewasmorerecentlydiscoveredtoinvolveincorporationofsulfurintoDNAofstrainsofS.lividans66,S.avermitilisNRRL8165,andP.fluorescensPf0-1by35Sfeedingexperimentandtobegovernedbyafivegenecluster,dndA-EinS.lividans.However,theprecisechemicalnatureofDNAsulfurmodificationremainedobscurealthoughextensiveefforthadbeenmade.

HerewesetouttodefinethechemicalstructureoftheDNAsulfurmodificationbyfirstisolating35SlabelednucleosidesfromDndphenotypebacterialstrainsE.coliB7AandE.coliDH10B（pJTU1238）culturedwith35S-cysteine.DNAisolatedfromthesestrainswashydrolyzedanddephosphorylatedandtheresultingnucleosidesresolvedbyHPLCfollowedbyscintillationcountingtolocalize35S-containingfractions.

Havingestablishedchromatographicparametersfor35S-containingspecies,wenextcharacterizedthechemicalpropertiesofthemoleculesbyLC-MSusingthesameHPLCconditionswhichrevealedreproduciblem/zvaluesof597,446,348,152and136.ThesedatasuggestedthepresenceofaG-andA-containingdideoxynucleotidestructureforthem/z597molecularion,withlossofguanineyieldingtheionatm/zof446.The16massunitincreaseoveracanonicaldG-dAdinucleotide,theexpectedmassesforGandAreleasedfromtheputativedinucleotide,andthenucleaseresistanceoftheputativedinucleotidespeciessuggestedthepresenceofasulfuratominthesugar-phosphatebackbone,mostlikelythephorphorothioate-containingspecies.Theinvolvementofsulfuratomcausestwostereoisomerofphosphorothioatebond,RPandSP.

Tocorroboratethephosphorothioatestructureandtodefineitsstereochemistry,weemployedsyntheticphosphorothioate-containingdideoxynucleotides5'

and5'

eachwiththechiralRPorSPconfigurationofthephosphorous-sulfurbond.Ofthesemodelcompounds,5'

RPhadanHPLCretentiontime,high-resolutionmassspectralcharacteristicsandLC/MS（4）patternidenticaltomaterialobservedinB7AandDH10B（pJTU1238）.

WhenDH10B（pJTU1238）andB7AgenomicDNAwerehydrolyzedwithonlysnakevenomphosphodiesterase（specifictoRPconfiguration）andalkalinephosphatase,wecouldnotdetecteithertheRPorSPisomersof5'

byLC-MS.TheseresultssuggestthatphosphorothioationofDNAbytheDndmodificationsystemisatleaststereo-selectivefortheRPconfigurationofthephosphorothioate.WethusconcludethattheS-containingspeciesfromtheB7AandDH10B（pJTU1238）DNAisa5'

dideoxynucleosidewithanRPphosphorothioatebond.

Whilethepresentresultsdonotallowustoconcludethatthednd-dependentphosphorothioationofG-AsequencesintheE.colistrainsoccurssequencespecifically,anidenticalsetofstudiesperformedwithStreptomyceslividans1326,whichdisplaystheDndphenotype,revealeda5'

RPspecies.Nophosphorothioateformcouldbedetectedinamutant（ZX1）deficientinthedndgenecluster.

ToverifythatthephosphorothioatemodificationisindeedthebasisfortheDndphenotype,weperformedaninvitroTris-dependentDNAcleavageassayontheisolatednativeandsynthetic

d（GPSA）（Rp）speciesandonthesyntheticd（GA）dinucleotideasanegativecontrol.Bothnativeandsyntheticd（GPSA）（Rp）,butnotd（GA）,degradedasexpectedfortheDndphenotype.

Thewidespreadpresenceofthephenotypeinmorethan100microbeisolatesandofsetsofdndgenehomologsindiversemicroorganismssuggeststhatthephosphorothioationmayrepresentatypeofrestrictionmodificationsystem.Inadditiontothestructuralandreplicativecompatibilityofphosphorothioate-containingDNAmolecules,theknownresistanceofphosphorothioatelinkagesinnucleicacidstoavarietyofnucleaseactivities,andthepost-replicativeandsite-specificnatureofthemodificationsuggestthatphosphorothioatesinsertedbythedndmodificationsystemmightplayaprotectionmechanismforspecificDNAagainstnucleases.Toourknowledge,unlikeotherDNAorRNAmodificationsystems,DNAphosphorothioationbydndmodificationsystemisthefirstphysiologicalmodificationontheDNAbackbone.

Keywords:

DNAdegradation,Dndphenotype,dndgenecluster,DNAsulfurmodification,phosphorothioatebond,phosphorothioation

唐茹琦

精神分裂症相关基因的连锁不平衡分析和功能研究

唐茹琦，女，1981年02月出生，2003年09月师从于上海交通大学贺林教授，于2008年06月获博士学位。

精神分裂症是以基本个性改变，思维、情感、行为的分裂，精神活动与环境的不协调为主要特征的严重的精神疾病，在人群中的发病率约为1%。

流行病学研究表明，精神分裂症是由遗传和环境因素的共同作用而发生的一种复杂疾病，其中遗传因素发挥主要作用。

然而精神分裂症的遗传模式相当复杂，不同于孟德尔遗传规律，可能涉及多个中效和微效基因，未知的环境因素可能也有一定的影响，再加上该疾病诊断上的不确定，缺少生物学标记，这些都使得精神分裂症的遗传学研究变得更加困难。

连锁分析和连锁不平衡分析是近二十年寻找复杂疾病致病基因的主要方法。

NRG1,G72,DTNBP1等精神分裂症热门候选基因就是结合连锁分析和连锁不平衡分析方法确定的。

因此，用类似的方法可能是寻找其它精神分裂症易感基因的有效途径。

此外，在这些研究发现被完全肯定之前，确凿无疑的重复研究仍然是最重要的。

本文对精神分裂症易感基因Epsin4中的6个多态性位点在中国汉族核心家系中进行连锁不平衡分析。

通过传递不平衡检验，尽管没有发现单个遗传标记达到显著性水平（P=0.05），却发现由这些位点组成的单倍型和精神分裂症显著相关（globalP=0.002）。

因此，我们的结果暗示了在Epsin4基因5’区域可能存在着能影响疾病风险的功能位点，从而进一步证实了Epsin4是精神分裂症的易感基因。

研究报道PIK3C3基因核心启动子区域的两个多态性位点可能是精神分裂症潜在的功能变异。

我们在中国汉族散发人群中对这两个位点进行病例-对照分析，包括556个病人和563个正常对照。

研究结果发现这两个位点在病人和正常人中等位基因的频率有显著性差异。

其次，我们用荧光素酶报告基因系统检测发现这两个位点组成的单倍型对基因转录活性有显著性影响（P=0.002），HapT/C比HapC/-的转录活性高出20%。

综合连锁不平衡分析和荧光素酶报告基因的实验结果，我们支持PIK3C3是精神分裂症的易感基因。

基于中国汉族人群的病例-对照分析和核心家系的研究均支持IL-10基因启动子区的遗传变异和精神分裂症关联。

为此我们开展功能研究来检测这些位点是否是精神分裂症的功能变异。

首先使用凝胶迁移检测和疾病关联的SNP是否会影响某些转录因子的结合。

其次，采用荧光素酶报告基因的方法检测这三个SNPs组成的单倍型对基因转录活性的影响。

然而以上两个实验都没有得到阳性结果。

因此，我们认为这些SNPs是和潜在的功能位点处于连锁不平衡状态。

本论文在连锁不平衡分析的基础上，结合功能研究对Epsin4、PIK3C3和IL10三个精神分裂症相关基因进行研究，为精神分裂症分子遗传学研究提供了新的证据。

精神分裂症，连锁不平衡分析，病例-对照研究，传递不平衡检验，功能研究

LINKAGEDISEQUILIBRIUMANDFUNCTIONALSTUDYOFSCHIZOPHRENIARELATEDGENES

TangRuqi

Schizophreniaisaseverepsychiatricdisorderthataffectsabout1%oftheworld’spopulation.Thedisorderischaracterizedbypsychoticsymptomsinparticulardelusionsandhallucinations,reducedinterestanddrive,alteredemotionalreactivityanddisorganisedbehaviour.Itissuggestedthatschizophreniaiscontributedbygeneticandenvironmentalfactors,andgeneticfactorsplayadominantrole.Nevertheless,duetothelackofMendalianforms,theheritablemodelofschizophreniaisverycomplex.Therearemultiplesusceptibilitygenes,eachofsmalleffect,whichactinconjunctionwithenvironmentalfactors.Moreover,schizophreniaisabsentofadiagnosticneuropathologyorotherbiologicalmarker.Therefore,thesearchforchromosomelociandgeneshavebeenslowandfrustating.

Duringthepasttwodecades,linkageandassociationstudieshavebeenthemainapproachesinsearchingforcomplexdiseasegenes.Todate,therehavebeenseveralsuccessfulexampleswherecandidategenessuchasNRG1,G72,DTNBP1wereidentifiedthroughassociationanalysistargetingchromoso