范晶晶果酒质量安全综合分析评价副本副本文档格式.docx

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（陕西理工学院生物科学与工程学院食品专业101班，陕西汉中723000）

指导老师：

郑红星

1果酒简介

果酒是利用桔子汁发酵而成的低度果酒，不仅保留水果原有的风味而且在酿造过程中形成许多新的风味物质[1]。

果酒是选用无虫害无污染的绿色新鲜水果作为原料，用流动清水漂洗，以除去附着在果实上的泥土、杂物以及残留的农药和微生物，去皮、去筋络，将处理后的水果放入榨汁机中榨汁，榨汁后立即向果汁中添加SO2，在添加SO26h～12h后添加果酶以提高水果的出汁率和促进酒的澄清，添加适量的白砂糖提高发酵酒精度，接种，主发酵，发酵结束后要尽快进行酒渣分离，防止因为酵母自溶引起的酒质下降，用虹吸管将澄清的酒液分离出来，分离出的酒液尽量装满容器，立即补加SO2并密封陈酿，陈酿后的酒透明度不够，应对果酒进行澄清处理，处理后对酒精度糖度和酸度进行调配，使酒味协调，更加纯和爽口，杀菌、装瓶等工艺酿制而成。

果酒富含大量维生素C、柠檬酸及葡萄糖等物质，有降血脂、抗动脉粥样硬化等作用，同时对心血管疾病、肥胖及糖尿病也有预防作用。

且果酒属于低度酒，深受广大消费者喜爱。

2实验目的和实验意义

2.1实验目的

本实验以桔子酒为实验材料，针对桔子酒品质的特性，依据桔子酒的相关标准，对酿造的桔子果酒进行了感官指标、理化指标析以及微生物指标进行综合评价，进而确定质量指标是否达标，安全指标是否超标，从而对桔子酒的品质进行系统分析。

2.2实验意义

桔子果酒的开发不仅符合国家由粮食酒向水果酒转变的发展方向，同时也为桔子的深开发开辟了一条新路，具有十分广阔的市场前景。

因此，对桔子的开发利用蕴藏着较大的经济价值，为了加强人们对桔子果酒的认可，增强桔子果酒的市场竞争力。

对桔子进行深加工，尤其是发展桔子果酒产业极大地提高了桔子的附加值，不仅立足“三农”，改变了以往桔农增产不增收的局面，解决了农民卖桔难的问题，同时为农民增产增收提供了一条新的出路，保障了桔农的切身利益，有着巨大的经济效益和良好的社会效应。

3实验材料

桔子酒5个样品

4主要仪器和设备

高效液相色谱仪；

原子吸收分光光度计；

附温度计密度瓶；

二氧化硫测定装置；

恒温培养箱；

灭菌培养皿。

5实验方案

5.1桔子酒质量与安全指标的分析

参考桔子酒的相关标准，确定了理化指标为酒精度、滴定酸（以柠檬酸计）、挥发酸（以乙酸计）、总糖（以葡萄糖计）、干浸出物、柚皮苷、游离二氧化硫、总二氧化硫、铁、铅，卫生指标为菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌，通过查阅这些指标的检测方法标准，对这些指标进行分析检测。

5.2桔子酒感官、质量与安全指标的评价

参考桔子酒的相关标准，拟定桔子酒感官评价打分标准，采用打分法对桔子酒的色泽、香气、滋味、风格和杂质等感官指标进行评价，通过统计法评价桔子酒感官指标的优劣。

依据桔子酒的相关标准，确定质量指标是否达标，安全指标是否超标，从而对桔子酒的品质进行系统分析。

6实验方法

6.1感官指标

按GB/T15038（葡萄酒、果酒通用分析方法）有关规定执行[2]。

6.2理化指标

6.2.1酒精度

参考GB/T13662（黄酒）有关规定执行[3]。

6.2.2滴定酸、挥发酸

按GB/T15038（葡萄酒、果酒通用分析方法）规定方法进行。

6.2.3总糖

按GB/T15038（葡萄酒、果酒通用分析方法）规定方法进行。

6.2.4干浸出物

6.2.5柚皮苷

按GB/T15038（葡萄酒、果酒通用分析方法）附录A规定方法检测。

6.2.6游离二氧化硫、总二氧化硫

6.2.7铁

6.2.8铅

按GB5009.12（食品安全国家标准食品中铅的测定）规定方法进行[4]。

6.3微生物指标

6.3.1菌落总数

按GB/T4789.2（食品微生物学检验菌落总数测定）规定方法进行[5]。

6.3.2大肠菌群

按GB/T4789.3（食品微生物学检验大肠菌群计数）规定方法进行[6]。

6.3.3致病菌

沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌分别按GB/T4789.4（食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验）[7]、GB/T4789.5（食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验）[8]、2789.10（食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验）[9]规定方法进行。

7实验操作步骤

7.1桔子酒质量与安全指标的分析

7.1.1理化指标分析

7.1.1.1酒精度

在约20℃时，用容量瓶取桔子酒100mL，全部移入500mL蒸馏瓶中。

用100mL水分次洗涤容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，加数粒玻璃珠。

装上冷凝管，通入冷水，用原100mL容量瓶接收馏出液（外加冰浴）。

加热蒸馏，直至收集馏出液体积约95mL时，停止蒸馏。

于水浴中冷却至20℃，用水定容。

摇匀。

倒入100mL量筒中，测量馏出液的温度与酒精度。

按测得的实际温度和酒精度标示值查阅GB/T13662（黄酒）附录A，换算成20℃时的酒精度。

所得结果表示至一位小数。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

7.1.1.2挥发酸

实测挥发酸：

安装好蒸馏装置。

吸取10mL桔子酒（V（单位为mL））[液温20℃]在该装置上进行蒸馏，收集100mL馏出液。

将馏出液加热至沸，加入3滴酚酞指示液，用氢氧化钠标准滴定溶液（浓度c（单位为mol/L））滴定至粉红色，30s内不变色即为终点，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V1（单位为mL））。

测定游离二氧化硫：

于上述溶液中加入1滴盐酸溶液酸化，加2mL淀粉指示液和几粒碘化钾，混匀后用碘标准滴定溶液滴定，得出碘标准滴定溶液小号的体积（V2（单位为mL））。

测定结合二氧化硫：

在上述溶液中加入硼酸钠饱和溶液，至溶液显粉红色，继续用碘标准滴定溶液滴定，至溶液呈蓝色，得到碘标准滴定溶液消耗的体积（V3（单位为mL））。

结果计算

样品中实测挥发酸的含量按式

（1）计算。

=

………………………………………

（1）

所得结果应表示至一位小数。

7.1.1.3总糖

预备试验：

吸取费林溶液I、II各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失至呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积。

正式试验：

吸取费林溶液I、II各5.00mL于250mL三角瓶中，加50mL水和比预备试验少1mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积（V）。

费林溶液I、II各5.00mL相当于葡萄糖的克数按式（3）计算：

F=

………………………………………（3）

式中：

F一费林溶液I、II各5.00mL相当于葡萄糖的克数，单位为克（g）；

m一称取无水葡萄糖的质量，单位为克（g）；

V一消耗葡萄糖标准溶液的总体积，单位为毫升（mL）。

以桔子酒代替葡萄糖标准溶液，按上述步骤进行同样操作，记录消耗试样的体积（V3（单位为mL）），结果按式（4）计算。

测定含糖量较低的半干桔子酒，先吸取一定量桔子酒（V3（单位为mL））[液温20℃]于预先装有菲林溶液I、II液各5.0mL的250mL三角瓶中，再用葡萄糖标准溶液（浓度c（单位为mol/L））按上述步骤进行同样操作，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积（V（单位为mL）），结果按式（5）计算。

结果计算

干桔子酒、半干桔子酒总糖或还原糖的含量按式（4）计算，其他桔子酒按式（5）计算。

……………………（4）

………………………（5）

式中:

V1一吸取样品的体积，单位为毫升（mL）；

V2一样品稀释后或水解定容的体积，单位为毫升（mL）；

所得结果应表示至一位小数。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的2%。

7.1.1.4干浸出物

用100mL容量瓶量取100mL桔子酒（液温20℃），倒入200mL瓷蒸发皿中，于水浴上蒸发至约为原体积的三分之一取下，冷却后，将残液小心地移入原容量瓶中，用水多次荡洗蒸发皿，洗液并入容量瓶中，于20℃定容至刻度。

将密度瓶洗净并干燥，带温度计和侧孔罩称量。

重复干燥和称量，直至恒重（m）；

取下温度计，将煮沸冷却至15℃左右的蒸馏水注满恒重的密度瓶，插上温度计，瓶中不得有气泡。

将密度瓶浸入20.0℃±

0.1℃的恒温水浴中，待内容物温度达20℃，并保持10min不变后，用滤纸吸去侧管溢出的液体，使侧管中的液面与侧管管口齐平，立即盖好侧孔罩，取出密度瓶，用滤纸擦干瓶壁上的水，立即称量（m1）。

将密度瓶中的水倒出，用试样（7.5.3）反复冲洗密度瓶3次～5次，然后装满，按上述b）同样操作，称量（m2）。

并按下式计算出脱醇样品20℃时的密度ρ1。

以ρ1×

1.00180的值，查阅相应的表，得出总浸出物含量（g/L）。

7.1.1.5柚皮苷

精密称取减压干燥至恒重的柚皮苷标准样品5.0mg，用甲醇定容于10mL容量瓶，得0.5mg/mL标准母液。

精密量取标准母液适量，配置25,50,150,200,250μg/mL标准溶液，在仪器设定条件下进样10μL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准工作曲线。

精密量取取桔子酒5.0mL，精密加入50%甲醇5.0mL，称定质量。

超声波振荡20min，再次称定质量，不足质量用50%甲醇补足。

样品上离心机3000转/min离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜后在仪器设定条件下检测峰面积，以外标法计算样品中柚皮苷浓度C。

计算公式如下：

柚皮苷=C×

10/5（mg/L）

C为柚皮苷计算浓度

7.1.1.6直接碘量法测定游离二氧化硫的含量

吸取50.00mL桔子酒（液温20℃）于250mL碘量瓶中，加入少量碎冰块，再加入1mL淀粉指示液、10mL硫酸溶液，用碘标准滴定溶液（浓度c（单位为（单位为mL））迅速滴定至淡蓝色，保持30s不变即为终点，记下消耗碘标准溶液的体积（V（单位为mL））。

以水代替样品，做空白试验，操作同上。

样品中游离二氧化硫的含量按式（12）计算。

…………………………（12）

V0一空白试验消耗碘标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；

所得结果表示至整数。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

7.1.1.7直接碘量法测定总二氧化硫的含量

吸取25.00mL氢氧化钠溶液于250mL碘量瓶中，再准确吸取25.00mL样品（液温20℃）,并以吸管尖插入氢氧化钠溶液的方式，加入到碘量瓶中，摇匀，盖塞，静置15min后，再加入少量碎冰块、1mL淀粉指示液、10mL硫酸溶液，摇匀，用碘标准滴定溶液（浓度c（单位为mol/L））迅速滴定至淡蓝色，30s内不变即为终点，记下消耗碘标准滴定溶液的体积（V（单位为mL））。

样品中总二氧化硫的含量按式（13）计算。

…………………………（13）

V0一空白试验消耗碘标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）

7.1.1.8原子吸收分光光度法测定铁的含量

标准工作曲线的绘制：

置仪器于合适的工作状态，调波长至248.3nm，导入标准系列溶液，以零管调零，分别测定其吸光度。

以铁的含量对应吸光度绘制标准工作曲线（或者建立回归方程）。

试样的测定：

将桔子酒导入仪器，测其吸光度，然后根据吸光度在标准曲线上查得铁的含量（或带入回归方程计算）。

样品中铁的含量按式（14）计算。

…………………………（14）

X一样品中铁的含量，单位为毫克每升（mg/L）；

A一试样中铁的含量，单位为毫克每升（mg/L）；

F一样品稀释倍数。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

7.1.1.9氢化物原子荧光光谱法测定铅的含量

湿消解：

量取桔子酒2.00mL～10.00mL（均精确到0.001g）,置于50mL～100mL消化容器中（锥形瓶），然后加入硝酸+高氯酸混合酸5mL～10mL摇匀浸泡，放置过夜。

次日置于电热板上加热消解，至消化液呈淡黄色或无色（如消解过程色泽较深，稍冷补加少量硝酸，继续消解），稍冷加入20mL水再继续加热赶酸，至消解液0.5mL～1.0mL止，冷却后用少量水转入25mL容量瓶中，并加入盐酸0.5mL,草酸溶液0.5mL,摇匀，再加入铁氰化钾溶液1.00mL，用水准确稀释至25mL,摇匀，放置30min后测定。

同时做试剂空白。

标准系列制备：

在25mL容量瓶中，依次准确加入铅标准使用液0.00mL、0.125mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL（各相当于铅浓度0.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、30.0ng/mL、40.0ng/mL、50.0ng/mL），用少量水稀释后，加入0.5mL盐酸和0.5mL草酸溶液0.5mL摇匀，再加入铁氰化钾溶液1.00mL，用水准确稀释至刻度，摇匀。

放置30min后待测。

测定：

设定好仪器的最佳条件，逐步将炉温升至所需温度，稳定10min～20min后开始测量：

连续用标准系列的零管进样，待读数稳定之后，转入标准系列的测量，绘制标准曲线，转入桔子酒试样测量，分别测定试样空白和试样消化液，试样测定结果按式（15）计算。

……………………（15）

X一试样中铅含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；

C1一试样消化液测定浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

C0一试样空白液测定浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V一试样消化液定量总体积，单位为毫升（mL）；

m一试样质量或体积，单位为克或毫升（g或mL）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

7.1.2卫生指标分析

7.1.2.1菌落总数的检测

在无菌操作条件下，用吸管取25ml桔子酒，放于含有225ml灭菌生理盐水的500ml灭菌玻璃三角瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠），经充分振摇做成1：

10的均匀稀释液。

用1ml灭菌吸管吸取1：

10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：

100的稀释液。

另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

根据食品卫生检验标准要求和检样的菌落数量，选择3个连续适宜稀释度即10、10－1、10－2，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。

稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿15ml～20mL，并转动平皿使与稀释检样混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

等琼脂凝固后，翻转平板，置36±

1℃恒温箱内培养（48±

2）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1mL样品所含菌落总数。

做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

判定所检测样品菌落总数是否符合国家标准

7.1.2.2大肠菌群计数

以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:

10的样品匀液。

样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:

10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:

100的样品匀液。

根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±

1℃培养24h±

2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±

2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±

2h，产气者进行复发酵试验。

未产气者为大肠菌群阴性。

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±

1℃培养48h±

2h，观察产气情况。

产气者，计为大肠菌群阳性管。

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查GB4789.3（食品微生物学检验大肠菌群计数）MPN检索表，报告每100mL桔子酒中大肠菌群的最可能数。

7.1.2.3沙门氏菌检验

量取25mL桔子酒于盛有225mLBPW的500mL锥形瓶中，于36℃±

1℃培养8h～18h。

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±

1℃培养18h～24h。

同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±

1℃培养18h～24h。

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。

于36℃±

1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；

接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±

1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。

在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，观察菌落特征。

接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。

于36℃±

1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，将已挑菌

落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据上述的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

7.1.2.4志贺氏菌检验

以无菌操作取桔子酒25mL，加入装有225mLGN志贺氏菌增菌肉增菌液的广口瓶中。

放于36℃培养6～8h,培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。

取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；

另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或EMB琼脂平板各1个，放于36℃培养18～24h。

接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基从HE或SS、麦康凯或EMB琼脂平板、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。

一般应多挑几个菌落，以防遗漏。

经36℃培养18～24h，分别观察结果。

凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行进一步的生化试验和生化分型实验。

7.1.2.5金黄色葡萄球菌检验

吸取25mL桔子酒至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀，做成l：

l0的稀释液。

吸取5mL1：

10的检样稀释液，接种于50mL已灭菌的7.5%Nacl肉汤培养基内，37℃培养24h。

同时以5mL生理盐水接种于50mL已灭菌的7.5%Nacl肉汤培养基内做对照。

此外，从金黄色葡萄球菌斜面试管种上接种一环于50mL已灭菌的7.5%Nacl肉汤培养基内做平板分离培养的对照。

平板分离培养：

从呈均匀浑浊生长的增菌培养液中取一环，划线接种于B－P平板,37℃培养24－48h，观察菌落形态。

镜检与革兰氏染色试验：

从B-P平板上挑取金黄色葡萄球菌的典型菌落进行镜检和革兰氏染色。

如发现葡萄球菌,再做血浆凝固酶试验。

根据B－P平板培养和镜检及革兰氏染色，报告有无金黄色葡萄球菌存在。

7.2桔子酒感官、质量和安全指标评价

7.2.1桔子酒食味感官评价

打分法：

分值范围1~10，取整数（很喜欢9~10，喜欢6~8，一般3~5，不喜欢1~2），见表4。

分别发放给50名品评员进行打分，经过统计后以分值最高的样品品质越好。

具体操作方法参考下表：

表4桔子酒品质感官检验量化打分表

检验项目

打分标准

内涵诠释

1号样

2号样

3号样

4号样

5号样

色泽

越接近桔子本色分数越高

橙黄色、澄清透明、无明显悬浮物

滋味

对其滋味喜好程度打分

酸甜净爽、口感柔和、酒体丰满

香气

气味越接近柑橘本底分值越高

具有纯正协调的柑橘香味与酒香

澄清度

透光度光泽度越好分越高

澄清透明、有光泽、无明显悬浮物、使用软木塞封口的桔子果酒允许少量软木渣，瓶装超过一年允许有少量沉淀

起泡程度

微细的气泡持续性好观感好分数越高

倒入杯中，应该有微细的串珠状气泡升起，并有一定的持续性

典型性

个人喜好

具有柑橘果酒应有的特征和风格

7.2.2桔子酒理化指标评价

项目

指标要求（按Q/CJY00085